基于“腎主骨生髓”理論觀察補腎活血湯對絕經后骨質疏松癥β-catenin 蛋白表達影響及相關性分析*

盧愛民，尹君，李春峰，龍大偉

1 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230000

2 安徽中醫藥大學附屬太和中醫院 安徽太和 236600

絕經后骨質疏松癥是以絕經后女性為發病群體的全身性骨代謝性疾病[1]。骨形成和骨吸收失衡所導致的骨重塑負性平衡引起骨量的流失，骨組織微結構被破壞，易發生脆性骨折[2]。流調顯示[3]我國50 歲以上女性群體骨質疏松癥患病率達32.1%，顯著高于歐美國家。預測顯示[4]到2050 年中國≥50 歲人群骨質疏松癥相關性骨折將達599 萬例。而且骨質疏松性骨折是骨質疏松癥的嚴重后果，特別是髖部骨折，具有高致死率及致殘率[5]。盡管鈣劑和骨吸收抑制劑雙磷酸鹽類是臨床基礎治療和一線用藥[6]，但其副作用也大大降低了患者的依從性。研究發現[7]補腎復方對免疫調節細胞、激素或細胞因子表達、骨代謝及多種信號通路的調節效果顯著。凌家艷等通過補腎通絡方對去勢骨質疏松癥模型大鼠的研究顯示[8]補腎復方可有效改善去勢大鼠性激素水平及骨密度，且可通過上調去卵巢大鼠子宮內膜雌激素受體（ERα）表達，調控Wnt/β-catenin 信號通路，起到干預PMOP 的作用。而且馬陳等研究[9]發現青娥丸組PMOP 患者治療后β-catenin 蛋白水平較治療前顯著升高。此外韓學明等在對PMOP 患者與健康絕經后女性的對比研究發現PMOP 組β-catenin 蛋白水平明顯低于健康絕經后女性[10]。因此本研究基于“腎主骨生髓”理論觀察補腎活血湯聯合抗骨質疏松癥藥物對β-catenin 蛋白表達的影響并對其進行相關性分析。

資料與方法

1 診斷標準

參照原發性骨質疏松癥診斷標準[2]：①絕經后女性；②髖部或椎體發生脆性骨折者；③中軸骨BMD 或橈 骨 遠 端1/3BMD 的DXA 測T- 值≤-2.5；④BMD測量符合低骨量（-2.5＜T-值＜-1.0）同時伴脆性骨折（肱骨近端、骨盆或前臂遠端）。（除①外另須符合②、③、④其中之一）

2 入組標準

2.1 納入標準 ①符合如上診斷標準者；②辨證分型為腎虛血瘀證者；②患者年齡50 ～65 歲，且原發型絕經時間≥1 年；③參與本研究半年前無抗骨質疏松癥相關治療者；④自愿參與本研究并簽署知情同意書者。

2.2 排除標準 ①伴有較嚴重心肺功能性異常或器質性病理改變者；②伴有肝腎代謝功能異常或近期服用激素制劑者；③伴有甲狀腺功能異常者；④伴有胃腸功能明顯異常者；⑤伴有精神障礙或認知異常者；⑥治療周期內由于依從性等問題未能完成有效治療者。

3 一般資料

2020 年9 月—2022 年6 月就診于安徽中醫藥大學附屬太和中醫院骨科門診或健康體檢中心的PMOP患者中篩選符合納入標準的72 例患者，采用隨機數字表法隨機分為觀察組36 例和對照組36 例。觀察組患者年齡50 ～62 歲，平均年齡（56.42±2.75）歲；絕經時間1 ～7 年，平均時間（3.33±1.74）年；體重指 數20 ～30kg/m2，平 均 指 數（22.61±2.82）kg/m2。對照組患者年齡50 ～61 歲，平均年齡（55.72±2.78）歲；絕經時間1 ～7 年，平均時間（3.78±1.69）年；體重指數20 ～31kg/m2，平均指數（23.25±2.97）kg/m2。2 組患者的一般資料進行統計學比較，差異均無統計學意義，治療結果具有可比性。本研究經我院倫理委員會研究批準，且均獲得了入組PMOP 患者同意并簽署了知情同意書。

4 治療方法

4.1 對照組 予以鈣劑，碳酸鈣片（珠海同源藥業有限公司，國藥準字H44024255，0.75g×30 片，片劑），每日3 次，每次1 片；骨吸收抑制劑，阿侖膦酸鈉（北京福元醫藥，國藥準字H20059029，70mg×4 片，片劑），每周1次，每次1 片。上述治療藥物連續服用周期3 個月，定期隨訪記錄不良反應情況。

4.2 觀察組 在對照組用藥基礎上予以補腎活血湯。補腎活血湯出自《傷科大成》，組方包括熟地、補骨脂、菟絲子各10g，杜仲、枸杞、歸尾、山萸肉、蓯蓉、沒藥、獨活各3g，紅花2g，由我院中藥房統一煎煮，日1 劑，2 分服，連續服用3 個月。

5 觀察指標與療效評估

5.1 觀察指標 包括①骨密度：腰椎L1-4BMD、左側股骨頸BMD；②骨形成標志物 PINP；③骨吸收標志物S-CTX；④β-catenin 蛋白；⑤雌二醇E2；⑥中醫證候量表總積分[11]，見表1。

表1 中醫證候量表

5.2 檢測方法 使用康源國際醫療器械公司DEXA雙能X 線骨密度儀檢測2 組患者治療前后的腰椎L1-4BMD、左側股骨頸BMD；抽取2 組患者治療前后靜脈血5mL（禁食水6h 后空腹靜脈血），在3000 r/min 離心15 min 后收集血清，使用相應試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司提供）通過酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測PINP、S-CTX、β-catenin 蛋白水平；常規方法采血化驗血清E2水平。

5.3 療效評估標準 參照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[12]將臨床療效劃分為痊愈、顯效、有效、無效四級，采用尼莫地平法進行療效評定。癥狀療效指數（R）＝[（治療前證候總積分-治療后證候總積分）/治療前證候總積分]×100%。痊愈：R ≥90%；顯效：60%≤R＜90%；有效：30%≤R＜60%；無效：R＜30%。

6 統計學方法

使用SPSS25.0 軟件進行數據統計分析，計量資料用（±s）表示，各組進行正態性、方差齊性檢驗，符合條件采用獨立樣本t檢驗，不符合采用曼-惠特尼秩和檢驗（Mann-Whitney U test）；計數資料比較采用χ2檢驗（四格表法）；相關性檢驗采用 Pearson 相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 2 組治療前后骨密度結果比較

2 組治療前患者腰椎L1-4BMD 和左側股骨頸BMD 進行組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），數據具有可比性。2 組治療后患者腰椎L1-4BMD 和左側股骨頸BMD 均較治療前增高，差異有統計學意義（P＜0.05），且觀察組指標水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 2 組腰椎L1-4BMD 和左側股骨頸BMD 比較（±s）

表2 2 組腰椎L1-4BMD 和左側股骨頸BMD 比較（±s）

BMD/g·cm-2 例數 觀察組 對照組 t組間 P組間治療前腰椎（L1-4） 36 0.664±0.039 0.659±0.033 -0.489 0.097治療后腰椎（L1-4） 36 0.818±0.052 0.774±0.039 -4.023 0.001 t組內 -60.216 -65.366 P組內 0.000 0.000治療前左側股骨頸 36 0.709±0.044 0.708±0.039 -0.141 0.172治療后左側股骨頸 36 0.805±0.032 0.748±0.038 -6.869 0.000 t組內 -42.275 -25.690 P組內 0.000 0.000

2 2 組治療前后骨轉換指標（BTM）結果比較

2 組治療前患者PINP 和S-CTX 表達水平進行組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），數據具有可比性。2 組治療后患者PINP 和S-CTX 表達水平均較治療前降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且治療后觀察組指標水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 2 組骨轉換指標PINP、S-CTX 水平比較（±s）

表3 2 組骨轉換指標PINP、S-CTX 水平比較（±s）

指標 治療前后 例數 觀察組 對照組 t組間 P組間PINP/ng·mL-1 治療前 36 64.39±15.868 63.97±16.184 -0.110 0.854治療后 36 43.78±8.333 49.56±10.840 2.535 0.017 t組內 14.358 14.818 P組內 0.000 0.000 S-CTX/ng·mL-1 治療前 36 0.886±0.144 0.897±0.140 0.332 0.705治療后 36 0.489±0.098 0.597±0.111 4.396 0.000 t組內 30.741 34.225 P組內 0.000 0.000

3 2 組治療前后中醫證候總積分比較

2 組治療前患者中醫證候總積分比較差異無統計學意義（P＞0.05），數據具有可比性。2 組治療后患者中醫證候總積分均較治療前降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且觀察組顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。中醫證候總積分 例數 治療前 治療后 t組內P組內

表4 2 組治療前后中醫證候總積分比較（±s）

表4 2 組治療前后中醫證候總積分比較（±s）

觀察組 36 15.56±4.01 7.58±3.64 27.109 0.000對照組 36 15.08±3.66 9.53±3.79 24.481 0.000 t組間 -0.522 2.221 P組間 0.303 0.018

4 2 組治療前后β-catenin 蛋白表達水平、血清E2 水平比較

2 組治療前患者β-catenin 蛋白水平、血清E2水平進行組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），數據具有可比性。2 組治療后與治療前β-catenin 蛋白水平、血清E2水平進行組內比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且治療后觀察組指標水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 2 組β-catenin 蛋白和血清E2 水平比較（±s）

表5 2 組β-catenin 蛋白和血清E2 水平比較（±s）

例數 觀察組 對照組 t組間 P組間治療前β-catenin/pg·mL-1 36 19.03±3.99 18.83±3.76 -0.213 0.780治療后β-catenin/pg·mL-1 36 26.67±3.94 23.14±3.61 -3.963 0.001 t組內 -28.223 -32.855 P組內 0.000 0.000治療前E2/pg·mL-1 36 12.14±3.31 12.42±3.51 0.346 0.651治療后E2/pg·mL-1 36 18.64±4.66 16.19±4.29 -2.317 0.028 t組內 -25.026 -20.637 P組內 0.000 0.000

5 2 組治療后有效率比較

2 組治療結束后有效率進行比較，有效率包括痊愈率、顯效率和有效率。觀察組有效率為91.67%；對照組有效率為71.22%，觀察組有效率明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明觀察組療效更優，見表6。

6 不良反應情況

2 組患者治療期間均出現了兩例患者嘔吐不適的胃腸反應，觀察組嘔吐患者考慮是由于空腹服用中藥湯劑引起的胃腸不適，且調整為餐后服用后未再出現；對照組嘔吐患者考慮是由于較長期服用藥物引起的不適。其他不良反應在治療期間無明顯表現。

7 β-catenin 蛋白與BMD、BTM、中醫證候總積分、血清E2 治療前后相關性分析

治療前后72 例患者β-catenin 蛋白表達水平與各觀察指標進行Pearson 相關性分析，與患者BMD、E2在治療前和治療后均呈正相關性（P＜0.01），與PINP、S-CTX、中醫證候總積分在治療前和治療后均呈負相關性（P＜0.01），見表7。

表7 治療前后β-catenin 蛋白相關性分析

討 論

PMOP 在中醫歸屬“骨痿、骨枯”范疇，中醫病機主要為“腎虛精虧、髓減骨枯、筋骨失養”，與腎臟關系密切[13]。《素問·上古天真論篇》記載：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長……四七，筋骨堅，發長極，身體盛壯。”闡明腎精充足，則髓充骨堅。PMOP 的發病與腎精不足而致髓化乏源、骨失所養密切相關[14]。因此補腎填精是治療PMOP 的基本治療大法。此外研究顯示補腎活血湯配合常規抗骨質疏松藥物，對于抑制骨量丟失，改善骨微結構療效顯著，且具有高安全性、低副作用特點[15]。 本研究組方中熟地黃、山茱萸、杜仲、枸杞子、補骨脂、菟絲子補腎強筋而壯骨；當歸、沒藥、紅花活血祛瘀而新。且本研究結果顯示補腎活血湯可顯著提高患者骨密度水平，改善患者中醫證候表現，這與王俊杰研究結果基本一致[16]。此外觀察組患者治療后血清E2水平較治療前明顯提高，表明補腎活血方可有效改善患者雌激素低水平狀態。李莉等在對OVX 大鼠模型研究[17]亦發現補腎法六味地黃湯可顯著提高其血清E2水平，改善骨密度，推測與其類激素樣作用密不可分。Wei 等通過對單味補腎藥淫羊藿有效成分淫羊藿苷的研究發現[18]其可以顯著上調成骨基因ERα 和Wnt 信號通路蛋白β-catenin 的表達，進而調節BMSCs 的成骨分化。這表明補腎類單味藥或復方對雌激素的正向調控作用。

此外骨轉換高速率的增加是骨量流失的主要原因[2]，而骨轉換標志物（BTM）作為評估PMOP 治療效果的生化標志物較BMD 而言更加敏感，此外還可以有效預測骨折風險。國際骨質疏松癥基金會（IOF）建議在骨質疏松癥的臨床研究中使用骨形成指標PINP 和骨吸收指標S-CTX 作為療效參考指標[19]。且本研究結果顯示補腎活血湯聯合療法顯著降低了BTM 表達水平。這與段俊紅等對肝腎陰虛型PMOP 患者的治療效果基本一致，均顯著改善了BMD 和BTM 水平[20]。

而β-catenin 蛋白作為經典Wnt/β-catenin 信號通路關鍵蛋白，其通過調控抑制骨髓間充質干細胞的脂肪分化，促進成骨分化機制減少或抑制骨量流失[21]。Xia 等通過補腎活血方的研究發現與OVX 小鼠相比，灌胃補腎活血方小鼠的β-catenin 和ALP mRNA 表達顯著增強，而FABP4 mRNA 則顯著降低，呈現抑制骨量流失、改善骨微結構、抑制脂肪分化效應，但敲除β-catenin 表達基因的OVX 小鼠其β-catenin 蛋白表達量及成骨細胞增殖分化情況較未敲除小鼠顯著降低，表明補腎活血方的抗骨質疏松作用主要通過β-catenin 信號傳導起作用[22]。本研究結果顯示觀察組β-catenin 蛋白表達水平效應更明顯。此外許兵等通過補腎活血含藥血清培養體外成骨細胞研究發現[23]含藥血清組β-catenin、Runx2 及Osx mRNA 表達量顯著提高，且成骨細胞的增殖分化活性明顯高于對照組，可以推測補腎活血顆粒通過激活經典Wnt/β-catenin 信號通路增強了成骨細胞增值分化的效應。這表明補腎活血方可有效改善PMOP患者體內β-catenin 蛋白低表達水平，進而激活Wnt/β-catenin 信號通路促進成骨分化。此外本研究通過對2 組患者治療前后體內β-catenin 蛋白表達水平進行的Pearson 相關性分析表明其作為Wnt 信號通路的關鍵蛋白，其表達水平的高低與降低PMOP 患者骨量流失，提高患者體內雌激素水平，降低骨轉換率，改善患者中醫證候關系密切。

綜上，補腎活血湯聯合常規抗骨質疏松藥物能夠有效增加PMOP 患者骨密度，促進骨重塑正性平衡，提高患者體內E2水平，改善患者中醫證候，促進β-catenin 蛋白表達，有效調控Wnt 信號通路，有利于PMOP 的防治。