神經遞質γ-氨基丁酸對小鼠B淋巴細胞分化和抗體生成的影響

宋廣平，吳 敏，梁麗云，李慧艷，張學敏，李 平，張宇程

（1.國家生物醫學分析中心，北京 100850；2.中國人民解放軍總醫院第一醫學中心腎臟病醫學部，北京 100853）

高親和力中和抗體可有效抵抗機體感染病原微生物，也是絕大多數疫苗發揮作用的基礎［1-3］。生發中心是機體遇到抗原刺激發生免疫反應時，在外周淋巴器官（如脾）或淋巴結中短暫存在的特定結構，是B淋巴細胞克隆增殖和親和力成熟的場所，在此最終篩選出能產生高親和力抗體的漿細胞［4-6］。目前，對生發中心調控的研究主要集中在B細胞與濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cells，Tfh）和濾泡樹突狀細胞互作方面，著重闡述Tfh 和濾泡樹突狀細胞如何通過分泌細胞因子及細胞表面的配體受體如何結合而調控B細胞成熟、生發中心形成、抗體類型轉換和體細胞超突變等功能［7-9］。但越來越多的研究表明，神經系統與免疫系統聯系緊密，且存在交互信息傳遞［10-11］。近年來研究發現，人Tfh 能分泌多巴胺作用于B 細胞，促進生發中心反應［12］；且腺苷酸可通過作用于Tfh上的腺苷酸受體，抑制Tfh 分化和生發中心B 細胞形成［13］。還有研究發現，大腦-脾的神經-免疫調控軸可通過去甲腎上腺素和乙酰膽堿等遞質，促進漿細胞的生成和疫苗接種引起的抗體免疫應答［14］。因此，神經遞質對B細胞分化的影響成為神經免疫領域的研究重點和前沿。

本研究以B細胞上表達的神經遞質受體為切入點，用B細胞體外分化體系和經典的乙酰化4-羥基-3 硝基苯基偶聯鑰孔血藍蛋白（4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl conjugated to keyhole limpet hemocyanin，NP-KLH）抗原免疫小鼠模擬疫苗接種模型，檢測神經遞質γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）對小鼠B細胞分化和抗體生成的影響，為相關疾病的治療和疫苗研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

雌性C57BL/6 小鼠，18～22 g，8～12 周，動物許可證號SCXK（京）2016-0011，北京維通利華實驗動物技術有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美 國Gibco 公 司；DMEM 培 養 基、RPMI 1640 培養基、青-鏈霉素雙抗、丙酮酸鈉、HEPES、胰蛋白酶、非必需氨基酸和EDTA，中科邁晨（北京）生物科技有限公司；Prime Script RT Master Mix，日本TaKaRa 公司；紅細胞裂解液和鋁佐劑，美國Thermo Fisher Scientific 公司；綿羊紅細胞（sheep red blood cells，SRBC），鄭州百基生物科技有限公司；NP-KLH、乙酰化4-羥基-3 硝基苯基偶聯牛血清蛋 白（4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl conjugated to bovine serum albumin，NP3-BSA），乙酰化4-羥基-3 硝基苯基偶聯藻紅蛋白（4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl conjugated to phycoerythrin，NP-PE），美國Biosearch Technologies公司；GABA，美國MCE公司；小鼠白細胞介素4（interleukin-4，IL-4），美國PeproTech 公司；HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體，美國Jackson Immuno Research 公司；生物素-大鼠抗小鼠CD19 抗體、EF450-大鼠抗小鼠IgM 抗體和FVS 死活細胞染料，美國eBioscience 公司；純化的大鼠抗小鼠CD16/32、FITC-大鼠抗小鼠B220、Per-CP-大鼠抗小鼠B220、BV510-大鼠抗小鼠B220、APC-大鼠抗小鼠GL7、太平洋藍（Pacific blue）-大鼠抗小鼠GL7、APC-大鼠抗小鼠CD138、PerCP-大鼠抗小鼠Gr-1、FITC-大鼠抗小鼠IgG1及PE-小鼠抗小鼠Fas 抗體，美國BioLegend 公司；FITC-大鼠抗小鼠CD19 抗體、PE-Cy7-倉鼠抗小鼠Fas 抗體和BD Cytofix/Cytoperm?細胞固定/通透液試劑盒，美國BD Biosciences 公司。磁力分選架、MS 分選柱、抗生物素的磁珠，美國Mitenyi Biotec 公司；Thermo FORMA311 型CO2培養箱和Q3 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；5424R 型低溫高速離心機和5424 型常溫高速離心機，德國Eppendorf公司；i3酶聯免疫檢測儀，美國Molecular Devices 公司；流式細胞儀BD FACS Aria Ⅱ，美國BD Biosciences公司。

1.2 B細胞轉錄組數據分析

為分析小鼠脾幼稚B細胞和生發中心B細胞上神經遞質受體表達，分析了Komban等［15］于2019年Nat Commun發表的研究論文附加原始轉錄組數據，該數據已上傳至https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE129103。通過生物信息學方法，分析B細胞上神經遞質受體表達。

1.3 流式細胞術分選SRBC 免疫小鼠幼稚B 細胞、生發中心B細胞和漿細胞

ip 給予1×109SRBC 免疫小鼠，7 d 后取脾，研磨并裂解紅細胞。取1×108脾細胞，用500 μL 無菌流式緩沖液〔PBS（pH 7.4）+1%FBS+5 mmol·L-1EDTA〕重懸細胞。加入5 μg 抗CD16/32 抗 體 冰上孵育10 min，封閉IgG 抗體受體。加入100 μL抗體混合液（FITC-大鼠抗小鼠B220 抗體4 μg、PE-Cy7-倉鼠抗小鼠Fas 抗體2 μg、太平洋藍-大鼠抗小鼠GL7 抗體2 μg 和APC-大鼠抗小鼠CD138 抗體2 μg），FVS 死活細胞染料按說明書加入。另設空白染色管及每種熒光抗體的單標管，將樣本與抗體混合均勻后4 ℃孵育30 min。最后加入流式緩沖液1 mL清洗細胞，500×g離心3 min，棄上清。用無菌PBS 5 mL 重懸細胞，加至流式上樣管內，用BD 流式細胞儀分選幼稚B 細胞（B220+FaslowGL7low）、生發中心B 細胞（B220+FashiGL7hi）和漿細胞（CD138+）。

1.4 RT-qPCR檢測幼稚B細胞、生發中心B細胞和漿細胞上GABA受體和轉運體mRNA表達

使用Trizol法分別提取幼稚B細胞、生發中心B細胞和漿細胞總RNA，用Prime Script RT Master Mix 逆轉錄試劑盒合成cDNA。取cDNA 500 ng和5×Prime Script Mix 2 μL，DEPC 水補充至10 μL，用Power Up SYBR Green Master Mix（AB）試劑盒進行熒光定量PCR 檢測。PCR 引物均據Primer Bank 網站設計，引物序列見表1，由生工生物科技有限公司合成。以GAPDH作為內參基因，利用2-ΔΔCt法計算待測基因mRNA相對表達水平。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.5 B細胞體外分化體系和GABA處理

NB-21 細胞培養基由DMEM 基礎培養基添加10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗和1%非必需氨基酸配制而成。當NB-21細胞擴增到約90%密度時，用胰蛋白酶消化，離心收集的細胞用臺盼藍染色進行活細胞計數，接種12孔板，每孔1×105細胞，5%CO2孵箱中培養過夜，作為B 細胞體外分化的飼養層細胞。

取8 周齡未免疫小鼠脾，研磨，裂解紅細胞，離心收集脾細胞并計數。用200 μL 磁珠緩沖液（PBS+1%BSA+EDTA 2 mmol·L-1）重懸2×107脾細胞，加入抗CD16/32 抗體2 μg 冰上孵育，封閉IgG 抗體受體10 min。加入生物素-大鼠抗小鼠CD19 抗體1 μg 和抗生物素微珠5 μL，利用磁珠法分離幼稚B細胞。

B 細胞體外分化體系：取B 細胞培養基（RPMI 1640 培養基添加10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗、1%非必需氨基酸、HEPES 10 mmol·L-1、丙酮酸鈉1 mmol·L-1、β巰基乙醇55 μmol·L-1），加入小鼠IL-4 2 μg·L-1，重懸幼稚B 細胞。移除NB-21 飼養層細胞培養基，每孔加入2×105幼稚B細胞。

B 細胞體外分化實驗分為4 組：細胞對照及GABA 0.2，1.0 和2.0 mmol·L-1組［16］，每組3 平行孔。從B 細胞體外培養分化第1 天起，每天半量換液，第5 天收集B 細胞，流式細胞儀分析IgG1+GL7+生發中心B細胞和CD138+漿細胞百分比。

1.6 NP-KLH免疫小鼠的制備和分組處理

小鼠隨機分為3 組：正常對照（7 只）、免疫+PBS（16 只）和免疫+GABA 組（16 只）。將溶解的1 g·L-1NP-KLH 抗原與等體積鋁佐劑混合均勻，除正常對照組外，每只小鼠（8 周齡）ip 給予NP-KLH 100 μg，免疫后ip給予PBS或GABA（20 mg·kg-1）［17］，每天1次，連續12 d。第13天處死正常對照組4只、免 疫+PBS 組7 只和免疫+GABA 組7 只小鼠，制備脾細胞進行流式分析。第27 天處死正常對照組3 只、免疫+PBS 組9 只和免疫+GABA 組9 只小鼠，制備骨髓細胞進行流式分析。

1.7 流式細胞術分析NP-KLH 免疫小鼠脾生發中心B細胞、總漿細胞和lgG1+漿細胞亞群

取1.6 分組處理的部分小鼠，NP-KLH 免疫后第13 天處死，取脾制備單細胞懸液，裂解紅細胞后調整細胞密度為5×1010L-1。取脾細胞100 μL，加入抗CD16/32抗體1 μg冰上孵育10 min，封閉IgG 抗體受體，按以下方案進行流式抗體孵育后于流式細胞儀檢測。①脾生發中心B 細胞染色：PerCP-大鼠抗小鼠B220抗體1 μg，APC-大鼠抗小鼠GL7抗體0.5 μg，PE-Cy7-小鼠抗小鼠Fas 抗體0.5 μg，FVS 死活細胞染料按說明書加入。②脾總漿細胞和IgG1

+漿細胞染色：PerCP-大鼠抗小鼠B220 抗體1 μg，APC-大鼠抗小鼠CD138 抗體0.5 μg，FVS 死活染料按說明書加入；染色30 min后用BD Cytofix/Cytoperm ?細胞固定/通透液試劑盒破膜，加入FITC-大鼠抗小鼠IgG1抗體0.5 μg染色。

1.8 流式細胞術分析NP-KLH免疫小鼠骨髓NP+lgM-漿細胞亞群分析

取1.6 分組處理的部分小鼠，NP-KLH 免疫后第27天處死，剪取小鼠一側股骨，用1 mL注射器吸FACS 緩沖液刺入關節處，將骨髓細胞沖至1.5 mL EP 管，裂解紅細胞后調整細胞密度為1×1010L-1。PerCP-大鼠抗小鼠Gr-1 抗體0.5 μg，FITC-大鼠抗小鼠B220抗體1 μg，APC-大鼠抗小鼠CD138抗體0.5 μg，FVS 死活細胞染料按說明書加入。染色30 min 后用BD Cytofix/Cytoperm?細胞固定/通透液試劑盒破膜，加入NP-PE 染料0.5 μg 和EF450-大鼠抗小鼠IgM 抗體0.5 μg。另設空白染色管和每種熒光抗體單標管。最后加入1 mL 流式緩沖液清洗細胞，500×g離心3 min，棄上清，用PBS 300 μL重懸細胞用于流式細胞儀分析。

1.9 ELlSA 檢測NP-KLH 免疫小鼠血清中抗原特異性lgG抗體

分別取1.6 處理的正常對照、免疫+PBS 和免疫+GABA 組脾漿細胞百分比接近平均值的3 只小鼠，NP-KLH 免疫后第13 天摘除眼球取血，制備血清，ELISA檢測血清中抗原特異性IgG抗體［14］，測定波長為450 nm。

1.10 統計學分析

實驗結果數據用±s表示。利用Flowjo10 分析流式細胞檢測的源文件，分析分化過程中不同階段B 細胞所占B 細胞總數百分比，并用流式等高線圖和散點圖展示。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用成組t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 B細胞上GABA受體和轉運體mRNA表達水平

通過分析已知B 細胞數據庫，發現小鼠脾中幼稚B 細胞和生發中心B 細胞均高表達GABA B1 型受體（GABA B receptor，subunit 1，Gabbr1）（圖1A）。用流式細胞儀分選出SRBC 免疫小鼠脾幼稚B 細胞（B220+FaslowGL7low）、生發中心B細胞（B220+FashiGL7hi）和漿細胞（CD138+）（圖1B），RT-qPCR檢測結果顯示，幼稚B細胞、生發中心B細胞和漿細胞主要表達GABA受體Gabbr1，其他受體和轉運體幾乎無表達（圖1C）。

Fig.1 Expression levels of γ-aminobutyric acid（GABA）receptors and transporters in B cells of mice. A：heat-map showed expressions of neurotransmitter receptors and transcripts from RNA-seq data of the splenic na?ve B cells and germinal center（GC）B cells.B：flow cytometry sorting strategy for na?ve B cells（B220+FaslowGL7low），germinal center（GC）B cells（B220+FashiGL7hi）and splenic plasma cells（SPPCs）（CD138+）from the spleens of mice on the 7th day after sheep red blood cell immunization.C：mRNA expressions of GABA receptors and transporters in sorted na?ve B cells，GC B cells and SPPC detected by RT-qPCR.±s，n=3.Drd5：dopamine receptor D5；Grm5：glutamate receptor，metabotropic 5；Oprl1：opioid receptor-like 1；Htr1a：5-hydroxytryptamine receptor 1A；Vipr1：vasoactive intestinal peptide receptor 1；Hrh2：histamine receptor H2；Adora1：adenosine A1 receptor；Chrnb1：cholinergic receptor nicotinic beta 1 subunit.

2.2 B細胞體外分化體系的建立

經磁珠分選后，B細胞純度達到91.8%（圖2A）。將其加入到NB-21 飼養層細胞上進行體外培養，并加IL-4 誘導B 細胞分化。流式細胞術測定結果表明，培養前5 d 漿細胞百分比逐漸升高至38.6%，第6天開始減少（27.3%）（圖2B）。

Fig.2 Changes of percentage of CD138+ plasma cells from isolated na?ve B cells of mice detected by flow cytometry. A: na?ve B cells (CD19+) purified from spleens of normal mice by anti-biotin microbeads；B: quantification of CD138+ plasma cells in in vitro plasma cell differentiation system.

2.3 GABA促進漿細胞的體外分化

如圖3 所示，B 細胞體外分化過程中加入不同濃度GABA 后，與細胞對照組相比，GABA 不影響IgG1+GL7+生發中心B 細胞形成，但GABA 1.0 和2.0 mmol·L-1明顯升高CD138+漿細胞百分比（P＜0.01），提示GABA可促進漿細胞體外分化。

Fig.3 GABA promoted differentiation of CD138+ plasma cells in vitro detected by flow cytometry. A and B: percentages of IgG1+GL7+ GC B cells and CD138+ SPPCs，respectively，after culture in in vitro plasma cell differentiation system alone or with GABA for 5 d.±s,n=3.＊＊P＜0.01,compared with cell control（GABA 0.0 mmol·L-1）group.

2.4 GABA促進NP-KLH免疫小鼠漿細胞分化

NP-KLH 免疫小鼠第13 天，流式細胞術檢測脾生發中心B 細胞和漿細胞百分比，圈門策略如圖4A所示。圖4B 和4C 結果顯示，與正常對照組相比，免疫+PBS 組小鼠生發中心B 細胞百分比明顯增高（P＜0.01），漿細胞（P＜0.05）和IgG1+漿細胞（P＜0.01）百分比亦明顯升高，提示抗原NP-KLH免疫小鼠成功。與免疫+PBS 組相比，免疫+GABA 組小鼠生發中心B 細胞無明顯變化，漿細胞（P＜0.01）和Ig G1+漿細胞（P＜0.05）百分比顯著升高。

2.5 GABA促進NP-KLH免疫小鼠骨髓抗原特異性漿細胞分化

NP-KLH 免疫小鼠第27 天后，流式細胞術檢測骨髓中NP+IgM-漿細胞百分比，圈門策略如圖5A 所示。與正常對照組相比，免疫+PBS 組小鼠骨髓中NP+IgM-漿細胞百分比明顯增多（P＜0.01），且免疫+GABA組顯著高于免疫+PBS 組（P＜0.05）（圖5B）。

Fig.5 GABA increased abundance of antigen-specific bone-marrow plasma cells (BMPCs) of mice after immunization with NP-KLH detected by flow cytometry. See Fig.4 for the mouse treatment. A and B: gating strategy and frequencies of NP-binding B220-CD138+IgM- (BMPCs) on the 27th day after NP-KLH immunization, respectively. x ±s, n=3 (normal control group), 9 (immunized+PBS and immunized+GABA groups).＊＊P＜0.01,compared with normal control group; #P＜0.05,compared with immunized+PBS group.

2.6 GABA 促進NP-KLH 免疫小鼠高親和力抗體生成

如圖6 所示，與正常對照組相比，免疫+PBS 組小鼠血清NP 特異性抗體明顯升高（P＜0.01），且免疫+GABA組顯著高于免疫+PBS組（P＜0.01）。

Fig.6 GABA enhanced antigen-specific antibody response of mice after immunization with NP-KLH.See Fig.4 for the mouse treatment. NP-specific IgG titers of mice were detected by ELISA on the 13rd day after NP-KLH immunization.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with immunized+PBS group.

3 討論

抗體是機體用于抵抗細菌、病毒等外來病原體侵襲的重要免疫分子，由B 細胞分化成的漿細胞分泌。但由于B 細胞在體外培養時極易凋亡，其分化體系一直是研究的熱點和難點。2011 年，日本Takuya Nojima 教授實驗室改造了BALB/c 小鼠3T3 細胞系，使其穩定表達小鼠CD40L 和B 細胞激活因子，稱為40LB 細胞［18］，將其作為B 細胞的飼養層細胞，才使B細胞長期體外培養和分化得以實現，但該體系漿細胞分化比例較低。在此基礎上，2016年美國Garnett Kelsoe 實驗室進一步改造40LB 細胞，使其穩定表達小鼠IL-21 得到NB-21 細胞，建立了目前公認的B細胞體外分化成漿細胞的體系［19］。

GABA 是一種重要的抑制性神經遞質，具有降血壓、促進乙酰膽堿合成和促進生長激素分泌等多種生理功能［20-21］，主要通過GABA 受體及GABA 轉運體等發揮作用［22］。據報道，其作用于巨噬細胞和T 細胞行使免疫調節功能，如GABA 通過GABA 轉運體2 改變細胞代謝方式從而調控M1 型巨噬細胞極化［23］，GABA 轉運體SLC6A13 缺乏能促進腸道感染時Th17 細胞的分化等［24］。然而，關于GABA能否調控B細胞分化和抗體生成尚無報道。

本研究成功建立B 細胞體外分化體系，分化過程中加入GABA 明顯提高CD138+漿細胞百分比，表明神經遞質GABA在體外能促進B細胞向漿細胞分化。Gabbr1 受體為G 蛋白偶聯受體［25］，在B 細胞上高表達，但該受體促進B 細胞分化的分子機制尚不清楚。本研究用流式細胞儀分選出SRBC 免疫小鼠脾幼稚B 細胞、生發中心B 細胞和漿細胞，發現它們均表達Gabbr1受體，其他受體和轉運體幾乎無表達。

GABA在小鼠血清中的生理濃度為2 mg·kg-1［26］。Ren 等［17］報道，ip 給予小鼠GABA 40 μg·kg-1～40 mg·kg-1可促進空腸組織IL-17 表達且呈濃度依賴性。NP-KLH 是一種T 細胞依賴性抗原，可在小鼠體內誘導出生發中心反應。本研究發現，NP-KLH 免疫后ip 給予小鼠GABA 20 mg·kg-1可促進漿細胞分化。GABA 在體內可促進Th17 細胞分化［24］，那么GABA 是否可直接促進B 細胞分化尚未見報道。為此本研究用流式細胞術分析NP-KLH免疫后小鼠脾Tfh 百分比，確定GABA 是否通過增加Tfh 數量而促進漿細胞生成。研究結果表明，ip給予GABA 20 mg·kg-1可促進NP-KLH 免疫小鼠脾B細胞向漿細胞分化。GABA是調節神經元間通訊的抑制性神經遞質，主要由GABA能神經元釋放。但最近有研究報道，GABA也能由脾和淋巴結等B細胞產生［16］。由此提示，機體受到抗原刺激時也可能由B細胞自分泌GABA而促進其向漿細胞分化并產生抗體。

綜上，神經遞質GABA 在B 細胞分化過程中具有調控功能，提示GABA 可能是一種有研究價值的促進體液免疫反應的靶點，有望為提高疫苗的有效性及機體抗病毒能力提供新策略。