當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片質(zhì)量均一性分析

畢 武 孫 輝 任 強(qiáng)

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 日照 276826

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，是我國(guó)常用大宗中藥材之一，為歷版《中國(guó)藥典》所收載[1]。主產(chǎn)甘肅東南部，以岷縣產(chǎn)量多，質(zhì)量好，其次為云南、四川、陜西、湖北等省。藥理研究表明，當(dāng)歸具有活血、補(bǔ)血、促進(jìn)造血、抗腫瘤等功用[2-7]；化學(xué)成分研究表明，當(dāng)歸中主要含有有機(jī)酸類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[8]，其中阿魏酸在2020年版《中國(guó)藥典》作為定量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

中藥飲片是中藥臨床應(yīng)用的主要形式之一，多以湯劑在臨床使用，因此中藥飲片質(zhì)量均一性在臨床應(yīng)用中意義重大。中藥飲片由于其來(lái)源藥材質(zhì)量參差不齊，化學(xué)成分含量差異很大，從而影響臨床用藥的療效和穩(wěn)定性。為克服中藥飲片這種應(yīng)用形式的不足，近年來(lái)有專家提出“中藥精準(zhǔn)煮散飲片”的概念[9]。中藥煮散最早可追溯至先秦，在唐宋盛行，是將中藥粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑。中藥煮散注重“藥力盡出”，但由于煮散需將藥材粉碎，導(dǎo)致藥材鑒別困難，到明清時(shí)期逐步被便于鑒別和流通的飲片所取代。

隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，中藥飲片應(yīng)用形式的不足有望改進(jìn)，中藥煮散被再度提出。中藥精準(zhǔn)煮散飲片是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工藝將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，同時(shí)有利于有效成分的溶出和自動(dòng)化調(diào)劑[10]。目前已有研究人員對(duì)制何首烏、雞血藤、三七、枳殼、肉桂等藥材進(jìn)行了精準(zhǔn)煮散飲片的研究[10-14]，近期也有人對(duì)當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的指紋圖譜和含量測(cè)定進(jìn)行了研究[15]，本研究重點(diǎn)對(duì)當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量均一性進(jìn)行了研究，以期為當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀LC-20AT(Shimadzu Corporation);Diamonsil(200 mm×4.6 mm, 5.0 μm)色譜柱；水浴鍋DZKW-D-2(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子天平(準(zhǔn)確至千分之一，Shimadzu Corporation)；溶劑過(guò)濾器(天津津騰公司)；醫(yī)用離心機(jī)TGL-185(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 阿魏酸(純度98%，批號(hào)：20140928，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。乙腈、冰醋酸為色譜純(Fisher)，其它試劑為分析純。

研究樣品為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，具體編號(hào)、產(chǎn)地及規(guī)格詳見表1。當(dāng)歸原飲片形態(tài)如圖1所示，當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片如圖2所示。

A：DG-1；B：DG-2；C：DG-3

A：40目；B：24目；C：5目

表1 當(dāng)歸藥材的來(lái)源信息

2 方法

2.1 煮散飲片與原飲片出膏率比較 取同一批次當(dāng)歸原飲片(批號(hào)：180626016)，粉碎，過(guò)篩，得到5～10目(2～4 mm)，10～24目(0.8～2 mm)和24～65目(0.25～0.8 mm)等不同粒度的煮散飲片。稱取原飲片及不同粒度煮散飲片各100 g，加8倍量水浸泡30 min，煮沸30 min，濾得煎煮液，剩下的殘?jiān)?倍量水煎煮30 min。合并兩次煎煮液，濃縮成100 mL溶液，得到1.0 g/mL藥液。精密吸取各供試液2 mL于蒸發(fā)皿中，干燥至恒重，稱重，計(jì)算出膏率。

2.2 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分含量比較

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸對(duì)照品，加70%甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，然后依次稀釋成每1 mL含5 μg、10 μg、50 μg、100 μg、250 μg、500 μg的系列對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別稱取不同批次的市售原飲片(S1～S3)各100 g，3批當(dāng)歸原飲片(S1～S3)等比例混合成400 g，粉碎過(guò)篩，取10～65目當(dāng)歸煮散飲片300 g，于紙上均勻攤平，平均分為9份，任意選取3份(S4～S6)，各稱量100 g，6份樣品按前述方法分別煎煮濃縮為1.0 g/mL藥液。精密量取，濃縮液2 mL置20 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，取適量試液離心，取上清液，即得供試液。

2.2.3 色譜條件 Diamonsil C18(2)(200 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，以乙腈(B)-0.1%冰醋酸水(A)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫0～18 min 19% B；18～30 min 19%～90% B；30～32 min 90%～19% B；32～40 min 19% B；檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm，按阿魏酸峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于5000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將配制好的系列對(duì)照品溶液按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，考察阿魏酸在上述色譜條件下的線性關(guān)系。

2.3 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分一致性比較 按 2.2 項(xiàng)下的方法制備供試液，準(zhǔn)確吸取各供試品溶液注入HPLC記錄色譜峰信息。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2004A版)對(duì)市售原飲片處理前后指紋圖譜相似度進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同粒度煮散飲片出膏率考察 出膏率考察結(jié)果如表2所示，從結(jié)果可以看出，與原飲片(出膏率5.27%)相比，不同粒徑的煮散飲片出膏率隨著粒徑的減小呈顯著增加的趨勢(shì)，出膏率分別為5.17%、5.69%、6.31%。由于煮散飲片粒徑不同出膏率不同，其中10～24目和24～65目出膏率相對(duì)較高，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用10～65目的煮散飲片。此外，實(shí)驗(yàn)顯示，煮散飲片粒度越大，飲片的澄清度越高，所有飲片都沒有出現(xiàn)糊化。

表2 當(dāng)歸原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率

3.2 色譜條件考察 將準(zhǔn)備好的對(duì)照品溶液和供試品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)照品及提取液色譜圖如圖3所示，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下阿魏酸分離度良好。以對(duì)照品的峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，回歸方程為：Y=13 176X-78 286(R2=0.9998)，表明阿魏酸在10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分含量的均一性 采用高效液相色譜法測(cè)定了不同形式飲片中指標(biāo)性成分阿魏酸的含量，不同批次精準(zhǔn)煮散飲片提取液與當(dāng)歸原飲片中指標(biāo)成分的含量具體見表3和表4。結(jié)果表明，混合煮散前，各批次當(dāng)歸飲片藥材中指標(biāo)成分阿魏酸平均含量為0.32 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.82%，批間差異較大；但將其混合制成煮散飲片后，阿魏酸成分的含量明顯增加，平均值為0.38 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為下降為2.63%，說(shuō)明煮散后質(zhì)量均一性有所改善。

表4 阿魏酸在當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片提取液中的含量測(cè)定

3.4 煮散飲片與原飲片的指紋圖譜均一性 由于飲片制成的湯劑成分較為復(fù)雜，因此采用了中藥整體質(zhì)量控制常用的指紋圖譜法對(duì)煮散飲片和原飲片進(jìn)行比較，具體結(jié)果如圖4所示，見表5。結(jié)果顯示：應(yīng)用現(xiàn)有的檢測(cè)方法，當(dāng)歸煮散飲片和原飲片樣品的色譜峰可以很好地匹配，相似度結(jié)果顯示：煮散飲片(S4～S6)的相似度均>0.997，指紋圖譜匹配更好。說(shuō)明了精準(zhǔn)煮散飲片與市售的原飲片在提取出的成分屬性上沒有顯著差異，采用指紋圖譜相似度分析法可用來(lái)鑒別當(dāng)歸煮散飲片的真?zhèn)吻闆r。以精準(zhǔn)煮散飲片水煎液中阿魏酸的平均峰面積為基準(zhǔn)，計(jì)算精準(zhǔn)煮散飲片和市售飲片水煎液主要共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表6。精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片無(wú)顯著差異。

圖4 當(dāng)歸原飲片(S1-S3)及精準(zhǔn)煮散飲片(S4-S6)圖譜

表5 當(dāng)歸原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片水煎液指紋圖譜的相似度

表6 當(dāng)歸原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片水煎液中 共有峰的相對(duì)峰面積

4 討論

為實(shí)現(xiàn)飲片的標(biāo)準(zhǔn)化和均勻化，精準(zhǔn)煮散飲片首先需要將飲片粉碎混勻，飲片粉碎粒度與飲片的出膏率等指標(biāo)密切相關(guān)，因此粉碎粒度是一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。為了考察當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散的效果，本實(shí)驗(yàn)比較了不同粒度的當(dāng)歸煮散飲片與原飲片出膏率差異，當(dāng)歸煮散飲片的出膏率與藥材粉碎的粒徑密切相關(guān)，粒徑減小出膏率明顯增加，據(jù)此獲得了合適的粉碎粒度，為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

為了解當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片質(zhì)量的一致性，進(jìn)一步采用HPLC法對(duì)其指標(biāo)成分阿魏酸含量測(cè)定，指紋圖譜法對(duì)飲片水煎煮后的總體成分相似度及其共有峰面積進(jìn)行了綜合比較。含量測(cè)定結(jié)果表明，煮散后指標(biāo)性成分阿魏酸雖有一定程度增加，但并不顯著，可能與藥材中阿魏酸含量情況有關(guān)，因此煮散飲片原藥材的質(zhì)量及其評(píng)價(jià)指標(biāo)也很重要；指紋圖譜評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，當(dāng)歸煮散飲片與其原飲片色譜峰數(shù)量基本一致，說(shuō)明其提取物在種類上無(wú)顯著變化，但煮散飲片主要共有峰的峰面積有不同程度的增加。總的來(lái)說(shuō)，煮散飲片可以較好地保持原飲片的質(zhì)量。

值得注意的是，阿魏酸雖為《中國(guó)藥典》2020版當(dāng)歸含量測(cè)定的指標(biāo)成分，但專屬性不足，用于評(píng)價(jià)當(dāng)歸煮散飲片的質(zhì)量還有待商榷。此外，精準(zhǔn)煮散飲片適合于根和莖類藥材、纖維含量較高且市場(chǎng)上飲片規(guī)格較多的飲片。一般含有揮發(fā)性成分的飲片，因粉碎過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分損失，且藥材粉碎后表面積增大增加揮發(fā)性成分揮發(fā)的速度，制成精準(zhǔn)煮散飲片需要重點(diǎn)關(guān)注。當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，揮發(fā)油總量也是其重要的控制指標(biāo)，在考察當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片時(shí)需要考慮對(duì)該類成分的評(píng)價(jià)，本研究考慮到粉碎和煎煮過(guò)程損失較大會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，所以未考慮揮發(fā)性成分，這是本文的不足之處。由于煮散飲片經(jīng)過(guò)粉碎后會(huì)出現(xiàn)性狀鑒定困難等不足，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需借助指紋圖譜等現(xiàn)代技術(shù)展開深入的研究，探討在保證當(dāng)歸煮散飲片原料真實(shí)性的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)煮散飲片質(zhì)量的有效性和均一性。俱蓉等[15]雖然考察了當(dāng)歸主要揮發(fā)性成分藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯I，但未能考察揮發(fā)性成分的指紋圖譜以綜合評(píng)價(jià)揮發(fā)性成分的穩(wěn)定性和均一性。

研究結(jié)果表明，當(dāng)歸煮散飲片與原飲片質(zhì)量具有良好的一致性，當(dāng)歸煮散飲片具有臨床應(yīng)用的可行性。由于煮散飲片可實(shí)現(xiàn)不同批次原料的均一性，因此，當(dāng)歸煮散飲片具有良好的臨床應(yīng)用前景。此外，隨著DNA條形碼鑒別技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)和指紋圖譜技術(shù)等可克服煮散形態(tài)鑒別困難的技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，煮散飲片應(yīng)用更加規(guī)范化、科學(xué)化和精準(zhǔn)化。現(xiàn)階段，在眾多新型飲片中，精準(zhǔn)煮散飲片因其更高的質(zhì)量均一性將成為普通飲片向“精準(zhǔn)化”轉(zhuǎn)型和升級(jí)的重藥飲片形式之一，也是中藥傳承、創(chuàng)新和發(fā)展的重要表現(xiàn)形式。