基于化學(xué)計量學(xué)的三七傷藥片質(zhì)量控制方法研究

趙振霞 雷 蓉 耿 蓮 朱 靖，2 劉永利*

1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，河北省中藥質(zhì)量評價與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，河北 石家莊 050227；2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017

三七傷藥片由三七、制草烏、雪上一枝蒿、冰片、骨碎補、紅花、接骨木、赤芍等組成，具有舒筋活血，散瘀止痛功效，是臨床骨傷科疾病中一種常用的中成藥，用于治療跌打損傷、風(fēng)濕瘀阻、關(guān)節(jié)痹痛，急慢性扭傷損傷等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-3]表明三七傷藥片還具有鎮(zhèn)痛、抗炎，改善血液流變性的作用，因此在臨床上更是得到了廣泛應(yīng)用。為控制藥品質(zhì)量及提高臨床用藥的安全性，本文對三七傷藥片中主要藥味的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究。該品種收載于《中國藥典》2020年版一部，鑒別項僅收載了三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和赤芍中芍藥苷的薄層色譜鑒別，對方中藥味控制較少，且未有對處方中君藥三七進(jìn)行含量測定，難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量[4]，因此，研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]建立了三七傷藥片中3種藥味的薄層色譜鑒別方法，并建立了三七中五種皂苷類成分的含量測定方法，再結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析影響三七傷藥片質(zhì)量的主要因素，為后續(xù)三七傷藥片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供可靠的技術(shù)保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(包括四元泵和紫外檢測器，美國賽默飛公司)；KQ-800KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SYG-1-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；FED56電熱恒溫干燥箱(德國賓德公司)；Mettler XPE26電子天平(瑞士梅特勒公司，0.001 mg)、Mettler XS105電子天平(瑞士梅特勒公司，0.01 mg)；Milli-Q 型超純水凈化系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)。

1.2 材料 冰片(批號：110713-201706)、骨碎補(批號：121169-202105)、柚皮苷(批號：110722-201714)、赤芍(批號：121093-201804)、芍藥苷(批號：110736-202145)、三七皂苷R1(批號：110745-201921)、人參皂苷Rg1(批號：110703-20235)、人參皂苷Re(批號：110754-202104)、人參皂苷Rb1(批號：110704-202230)、人參皂苷Rd(批號：111818-201302)，上述對照品及對照藥材均購買于中國食品藥品檢定研究院；17批次三七傷藥片樣品購自藥店，詳細(xì)信息見表1；乙腈(色譜純，德國Merck公司)，水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 17批次三七傷藥片樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別研究

2.1.1 冰片的TLC鑒別 取不同生產(chǎn)企業(yè)的三七傷藥片樣品三批(批號：20190813、191003、20191224)各40片，采用刮片法除去外層糖衣，置研缽內(nèi)研細(xì)后轉(zhuǎn)移至150 mL錐形瓶中，加入試劑乙醚20 mL，蓋緊瓶塞，室溫放置20 min后，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)10 min，過濾，濾液低溫?fù)]干，殘渣加三氯甲烷1 mL使其溶解，作為樣品溶液。按《中國藥典》2020年版一部三七傷藥片標(biāo)準(zhǔn)中【處方】比例與【制法】項下制備工藝，制備缺冰片藥味的陰性樣品，按“樣品溶液”項下方法制備陰性樣品溶液。取冰片對照品 1.052 mg，加三氯甲烷1 mL使其溶解，作為對照品溶液。吸取上述制得的三批樣品溶液、陰性樣品溶液及對照品溶液各5 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以顯色劑1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：樣品色譜中，在與冰片對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且斑點清晰、分離度好，陰性樣品無干擾(如圖1所示)，說明方法可行、專屬性良好。

1.冰片；2～4.樣品；5.陰性樣品

2.1.2 骨碎補的TLC鑒別 取不同生產(chǎn)企業(yè)的三七傷藥片樣品三批(批號：20190813、191003、20191224)各15片，采用刮片法除去外層糖衣，置研缽內(nèi)研細(xì)后轉(zhuǎn)移至150 mL錐形瓶中，加入試劑甲醇50 mL，82 ℃水浴條件下加熱回流提取1 h，過濾，將濾液蒸干后，殘渣加入水溶液20 mL使其溶解，然后用水飽和的正丁醇溶液振搖提取3次，每次用量均為25 mL，合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次用量均為 25 mL，正丁醇液置100 ℃水浴鍋上，蒸干，殘渣加入甲醇 1 mL 使其溶解，作為樣品溶液。按《中國藥典》2020年版一部三七傷藥片標(biāo)準(zhǔn)中【處方】比例與【制法】項下制備工藝，制備缺骨碎補藥味的陰性樣品，按照“樣品溶液”項下方法制備陰性樣品溶液。取骨碎補對照藥材2.0235 g，置150 mL錐形瓶中，加入乙醇15 mL，超聲處理(功率為 250 W，頻率為40 kHz)20 min，過濾，濾液置100 ℃水浴鍋上，蒸干，殘渣加入甲醇1 mL使其溶解，作為對照藥材溶液。另取柚皮苷對照品1.357 mg，加甲醇1 mL使其溶解，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述制得的三批樣品溶液和陰性樣品溶液各10 μL、骨碎補對照藥材和柚皮苷對照品溶液各5 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以顯色劑三氯化鋁試液，熱風(fēng)吹干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：樣品色譜中，在與骨碎補對照藥材和柚皮苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且斑點清晰、分離度好，陰性樣品無干擾(如圖2所示)，說明方法可行、專屬性良好。

1.柚皮苷；2.骨碎補；3～5.樣品；6.陰性樣品

2.1.3 赤芍的TLC鑒別 同骨碎補的TLC鑒別制備樣品溶液。按《中國藥典》2020年版一部三七傷藥片標(biāo)準(zhǔn)中【處方】比例與【制法】項下制備工藝，制備缺赤芍藥味的陰性樣品，按“樣品溶液”項下方法制備陰性樣品溶液。取赤芍對照藥材1.0827 g，置150 mL錐形瓶中，加入試劑乙醇15 mL，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)20 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使其溶解，作為對照藥材溶液。再取芍藥苷對照品1.079 mg，加甲醇1 mL使其溶解，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取三批樣品溶液和陰性樣品溶液各5 μL、赤芍對照藥材和芍藥苷對照品溶液各 2 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以顯色劑5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：樣品色譜中，在與赤芍對照藥材色譜和芍藥苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且斑點清晰、分離度好，陰性樣品無干擾(如圖3所示)，說明方法可行、專屬性良好。

1.芍藥苷；2.赤芍；3～5.樣品；6.陰性樣品

2.2 三七中5種成分含量測定

2.2.1 色譜條件 采用資生堂MGII C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相：以乙腈為流動相A，水為流動相B。梯度洗脫：0～15 min，A保持20%；15～35 min，A 20%→22%；35～50 min，A 22%→24%；50～110 min，A 24%→40%，流速為 1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為203 nm。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 混合對照品溶液 取待測五種皂苷類對照品，三七皂苷R17.529 mg、人參皂苷Rg125.306 mg、人參皂苷Re 5.145 mg、人參皂苷Rb125.179 mg和人參皂苷Rd 7.504 mg置同一25 mL量瓶中，加入甲醇約20 mL超聲處理(功率為 250 W，頻率為40 kHz)10 min使溶解，取出，放冷至室溫后，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2.2 樣品溶液 取三七傷藥片樣品(批號：20181202)20片，采用刮片法除去外層糖衣，精密稱定重量后，置研缽內(nèi)研細(xì)，取3.0045 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇提取液50 mL，稱定重量，82 ℃水浴條件下加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足回流過程中損失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL置蒸發(fā)皿中，水浴100 ℃條件下蒸干，殘渣加入水溶液25 mL使其溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次用量均為20 mL，棄去乙酸乙酯液，水液繼續(xù)用水飽和的正丁醇溶液振搖提取4次，每次用量均為25 mL，合并正丁醇提取液，水浴100 ℃條件下蒸干，殘渣加甲醇使其溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.2.2.3 陰性樣品溶液 按《中國藥典》三七傷藥片標(biāo)準(zhǔn)中【處方】比例與【制法】項下制備工藝，制備缺三七藥味的陰性樣品，按“樣品溶液”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗 取混合對照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)行分析，并記錄色譜圖，如圖4所示。在樣品色譜圖中，分別顯示與5種待測對照品保留時間一致的色譜峰，各色譜峰之間分離度良好，陰性樣品色譜圖中無相應(yīng)的色譜峰，說明方法可行，且除三七外的其它藥味不干擾三七傷藥片中待測成分的測定，方法專屬性良好。

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Re；4.人參皂苷Rb1；5.人參皂苷Rd；A.混合對照品；B.三七傷藥片樣品；C.陰性樣品

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取三七皂苷R131.18 mg、人參皂苷Rg189.98 mg、人參皂苷Re 23.40 mg、人參皂苷Rb191.08 mg及人參皂苷Rd 32.42 mg置同一10 mL量瓶中，加入甲醇約8 mL，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)15 min使溶解，取出，放冷至室溫后，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液。精密吸取上述對照品儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL，分別置于5個10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。精密吸取上述系列溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項下的色譜條件測定，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取按照“2.2.2”項下方法制備的批號為20181202的樣品溶液，分別在配制后0 h、3 h、7 h、13 h、19 h、24 h按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄上述6個時間點5種成分色譜峰峰面積積分值，并計算各成分的RSD值，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的RSD值分別為1.2%、1.0%、0.9%、0.4%、1.0%，結(jié)果表明本實驗制得的三七傷藥片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號：20181202)，采用刮片法除去外層糖衣，置研缽內(nèi)研細(xì)，取1.5 g、3.0 g、4.5 g各三份，精密稱定每份重量，按照“2.2.2”項下方法分別制備樣品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄每一份樣品中各成分峰面積積分值，計算5種皂苷類成分的含量及其RSD值，詳細(xì)結(jié)果見表3，表明本實驗建立的方法重復(fù)性良好。

表3 各成分重復(fù)性試驗結(jié)果 (n=9)

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取經(jīng)重復(fù)性試驗測定，含量已知的三七傷藥片樣品(批號：20181202)粉末9份，每份重量約1.5 g，每三份分為一組，分別加入用甲醇配制的低、中、高三個濃度的混合對照品溶液，按照“2.2.2”項下方法分別制備回收率測定用樣品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算每份樣品中待測成分回收率及其平均值和RSD值，詳細(xì)結(jié)果見表4，表明所建立的方法回收率良好。

表4 三七傷藥片5種成分加樣回收率試驗結(jié)果 (n=9)

2.3 樣品測定 取收集到的17批三七傷藥片樣品，按上述建立的方法進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示17批樣品，3個TLC鑒別均有相應(yīng)的斑點檢出，5種皂苷成分含量測定結(jié)果詳見表5。

表5 三七傷藥片含量測定結(jié)果 (mg/片，n=2)

2.4 基于化學(xué)計量學(xué)的三七傷藥片質(zhì)量分析 從以上的樣品檢驗結(jié)果可看出，收集到的17批樣品，3個薄層鑒別均有相應(yīng)的斑點檢出，全部符合規(guī)定，從鑒別的角度尚不能對樣品的品質(zhì)優(yōu)劣做出區(qū)分，于是針對三七中皂苷類成分的含量進(jìn)行了化學(xué)計量學(xué)的相關(guān)分析。

2.4.1 主成分分析(PCA) 將9個生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的共計17批次三七傷藥片樣品中五種皂苷成分的含量測定結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA分析，所有的數(shù)據(jù)都落在95%置信區(qū)間，且累積方差貢獻(xiàn)率R2X[1]與R2X[2]之和大于80%，說明所擬合的PCA得分圖有很好的參考性。17批樣品的二維PCA得分圖見圖5，從PCA得分圖可看出，17批樣品大致被分為了4類，同一企業(yè)的樣品基本都可聚到一類，但企業(yè)間樣品差距較大，企業(yè)3和企業(yè)7的樣品中皂苷成分的含量較高，聚為一類；而企業(yè)2和企業(yè)5的樣品含量較低，同樣聚為一類。

圖5 不同生產(chǎn)企業(yè)含量測定PCA得分圖

2.4.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 為了進(jìn)一步尋找三七傷藥片的差異質(zhì)量標(biāo)志物，以皂苷類成分的含量為變量，使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SIMCA 14.1對17批樣品進(jìn)行OPLS-DA分析，建立OPLS-DA模型，模型得分圖如圖6所示。由圖6可見，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，OPLS-DA能有效的將樣品進(jìn)行區(qū)分，且與PCA的分類結(jié)果基本一致。OPLS-DA模型中變量重要性投影值(variable importance for the projection，VIP值)可直觀反映出具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異質(zhì)量標(biāo)志物，根據(jù)VIP>1.0的原則，篩選差異組分，結(jié)果共找到2個成分，按照VIP值大小依次為三七皂苷R1(1.2131)>人參皂苷Rd(1.1260)。如圖7所示。

圖6 不同生產(chǎn)企業(yè)含量測定OPLS-DA得分圖

圖7 測定成分的VIP值圖

3 討論

3.1 薄層鑒別方法研究 參考2020年版《中國藥典》一部及相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，對組方中各味藥進(jìn)行TLC鑒別方法的探索，結(jié)果三七、紅花等藥味的鑒別方法因分離度較差、斑點不清晰等原因暫未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；制草烏、雪上一枝蒿為毒性藥味，需對其進(jìn)行嚴(yán)格控制，既要對毒性較大的雙酯型生物堿進(jìn)行限量檢查，又要對主要的藥效成分單酯型生物堿進(jìn)行含量測定，后續(xù)對其進(jìn)行了HPLC方法的一系列研究工作。本文采用TLC法建立了方中冰片、骨碎補、接骨木、赤芍3味藥的薄層色譜鑒別方法，經(jīng)過多次試驗選定薄層鑒別條件，結(jié)果方法簡便易行，斑點清晰圓整，分離度好，陰性無干擾，試驗過程中筆者還對多個廠家生產(chǎn)的薄層板(青島海洋化工廠、煙臺化學(xué)工業(yè)研究所、德國Merck公司)進(jìn)行了考察，結(jié)果均能很好地分離，表明所建立方法有較好的耐用性，可作為三七傷藥片的質(zhì)量控制方法。

3.2 流動相及供試品溶液制備方法的選擇 由于本品為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，為使三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd各色譜峰分離度達(dá)到要求，且峰形良好，本實驗參照相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]對色譜條件及樣品溶液的制備方法都進(jìn)行了優(yōu)化。預(yù)實驗中分別以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液(梯度洗脫)作為流動相進(jìn)行試驗，結(jié)果采用乙腈-水溶液時，色譜峰分離效果好，峰形較佳；在提取方式的選擇上，比較了直接提取、正丁醇萃取凈化處理、大孔吸附樹脂柱凈化處理的方法，結(jié)果采用正丁醇萃取凈化處理的方法，可較大程度去除雜質(zhì)峰的干擾；選擇供試品溶液提取溶劑時，將50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇作對比，結(jié)果甲醇提取效率最高。所建立的方法，被測成分色譜峰峰形良好，相互之間無干擾，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、選擇性強、耐用性好等特點，是控制三七傷藥片質(zhì)量的有效方法。

3.3 含量測定結(jié)果分析 本文采用HPLC法測定三七傷藥片制劑中5種皂苷類成分的含量，通過化學(xué)計量學(xué)的分析可知，同一廠家生產(chǎn)的不同批次樣品中，5種成分含量基本相當(dāng)，一致性較好，而不同廠家生產(chǎn)的樣品含量差異較大，且三七中的專屬性成分三七皂苷R1是影響其質(zhì)量的關(guān)鍵因素，因此亟需建立三七傷藥片中君藥三七的含量測定方法，且指標(biāo)成分的選擇不能僅限于五加科植物中共有的皂苷類成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1等，而必須對三七的專屬性成分三七皂苷R1加以控制，以確保其臨床療效的穩(wěn)定。產(chǎn)品的質(zhì)量與所用藥材質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等都有密切關(guān)系，要提高產(chǎn)品質(zhì)量，不但要監(jiān)控原料的質(zhì)量，而且還要對生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化、確保質(zhì)量的穩(wěn)定均一，所以建立能真正表征藥品品質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為重要[16]，質(zhì)量控制體系的建立應(yīng)以體現(xiàn)產(chǎn)品的質(zhì)量為核心。

綜上所述，研究同時建立了三七傷藥片中3味藥的薄層色譜鑒別方法及三七多指標(biāo)成分的含量測定方法，建立的質(zhì)量控制方法涉及藥味多，質(zhì)控成分種類多，能相對全面地控制三七傷藥片的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性與有效性。本次試驗過程中，筆者同時對系列品種三七傷藥膠囊與三七傷藥顆粒進(jìn)行了研究，對該系列制劑通用標(biāo)準(zhǔn)的建立具有指導(dǎo)意義，同時對全面控制產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效的一致性具有重要意義。