上清丸黃柏中鹽酸小檗堿含量測定及關黃柏摻偽或替代投料的檢查

肖琳婧 秦學玲 付興情 金 蒙 龍 琴 張赟華

云南省食品藥品監督檢驗研究院，云南 昆明 650106

上清丸源自《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加減”[1]，但與現行處方一致的上清丸最先記載于《北京市中藥成方選集》[2]。現標準收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十冊，標準編號為WS3-B-1878-95，標準收載大蜜丸和水丸兩種劑型，后根據藥典業發(1999)第175號文增加水蜜丸的規格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荊芥、防風、桔梗、連翹、梔子、黃芩(酒炒)、黃柏(酒炒)及大黃(酒炒)十二味藥材組成。具有清熱散風、解毒通便的功效。臨床上常用于頭暈耳鳴、目赤、鼻流黃涕、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便秘結[3]。文獻[4-6]報道，可采用HPLC方法對上清丸中的歐前胡素、黃芩苷、綠原酸、蒽醌等成分進行含量測定，但對上清丸中關黃柏摻偽及黃柏中鹽主要活性成分鹽酸小檗堿含量測定未見報道。

長期以來黃柏的價格高于關黃柏，因其化學成分相似，黃柏藥材在市場上常有用關黃柏冒充或摻入正品黃柏中使用的情況存在，與正品黃柏相比，關黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀含量相近，而正品黃柏二者含量差異較大，以關黃柏代替黃柏或兩者混合入藥勢必會影響藥效[7-11]。上清丸現行質量標準僅對黃柏行顯微鑒別，存在關黃柏摻偽或替代投料的風險，為打擊關黃柏替代或摻偽黃柏投料生產上清丸的違規行為，非常有必要建立HPLC法測定上清丸中鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿含量，并通過其峰面積的比值對關黃柏摻偽或替代投料進行檢查。

上清丸為2022年全國藥品抽檢中成藥重點監管品種之一，本次專項抽驗，共抽取上清丸樣品103批次。抽樣地域覆蓋了全國26個省、自治區、直轄市，涉及14家生產企業，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3種劑型。本實驗采用了HPLC測定了103批樣品中黃柏2個生物堿的含量，并通過鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿峰面積的比值，對上清丸中對關黃柏摻偽或替代投料進行檢查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；賽多利斯BS224S電子天平；賽多利斯SECURA225D電子天平。

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺黃柏陰性供試品溶液

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201814，含量以86.7%計)、鹽酸巴馬汀對照品(批號：110732-201913，含量以85.7%計)、黃柏對照藥材(批號：121510-201807)、關黃柏對照藥材(批號：120937-201408)均購自中國食品藥品檢定研究院，另購買5批黃柏藥材，均經鑒定，甲醇為色譜純(默克公司)，水為純化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品 方法學考察用的上清丸(水蜜丸，批號：A12003，廣州白云山陳李濟藥廠有限公司生產)，其余103批次上清丸樣品來源于14家生產企業，由于國家專項抽檢，涉及數據保密，生產企業由A～N代替。具體信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Waters xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(加入磷酸二氫鉀使其達到0.02 mol/L)(20∶80)等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長345 nm，柱溫25 ℃，進樣量為5 μL，理論板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于4000。

2.2 對照品溶液的制備 分別取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含取鹽酸小檗堿50 μg、鹽酸巴馬汀 5 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品重量差異項下大蜜丸，剪碎，精密稱定，取約2 g；取水丸或水蜜丸適量，研細，取約1 g，置具塞三角錐形瓶中，精密加入鹽酸∶甲醇(1∶100)25 mL，稱定重量，超聲40 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸∶甲醇(1∶100)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，在實驗室模擬工藝，配制缺黃柏細粉，取約1 g，同供試品溶液制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 系統適應性與專屬性試驗 按“2.2、2.3、2.4”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品，在上述試驗條件下，采用紫外檢測器檢測，測定，記錄色譜圖，如圖1所示。結果表明上述液相色譜條件下，供試品溶液色譜中呈現與對照品保留時間相同的色譜峰，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論板數以鹽酸小檗堿峰計均不低于4000，陰性供試品在相應位置處未見色譜峰，表明其他藥味不干擾兩種待測成分的測定，方法專屬性良好。

2.6 線性關系考察 精密稱定鹽酸小檗堿對照品10 mg置于20 mL量瓶中，鹽酸小檗堿母液(C=500 μg/mL)；精密稱定取鹽酸巴馬汀10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得鹽酸巴馬汀母液(C=100 μg/mL)；精密吸取鹽酸小檗堿母液5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，再精密吸取小檗堿稀釋液(C=100 μg/mL)1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得系列線性溶液；精密吸取鹽酸巴馬汀母液精密吸取5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，再精密吸取巴馬汀稀釋液(C=50 μg/mL)1 mL置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得系列線性溶液。

精密吸取上述線性對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進行測定。以各成分進樣量為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，線性測定數據、計算得回歸方程及相關系數見表2。

表2 線性關系考察表

2.7 精密度試驗 取混合對照品適量，按上述方法制備，連續6次測定，測得鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的峰面積RSD (n=6)分別為1.54%、1.58%，儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各進樣1次，測定各組分的峰面積，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積RSD(n=6)分別為0.55%、1.06%，樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.9 重復性試驗 取上清丸(水蜜丸，批號：A12003，廣州白云山陳李濟藥廠有限公司)按“2.3.2”項下操作，平行提取6份，測得結果見表3，表明該方法重復性良好。

表3 重復性試驗結果

2.10 加樣回收試驗 取已知含量的上清丸樣品(鹽酸小檗堿1.42 mg/g、鹽酸巴馬汀0.02 mg/g、)上清丸(水蜜丸，批號：A12003，廣州白云山陳李濟藥廠有限公司生產)，稱定6份，每份取約0.5 g，精密稱定，采用加樣回收試驗方法，分別按下表精密加入兩種對照品溶液，具體稱樣量、加入量。測定結果見表4，表明該方法可行。

表4 加樣回收率實驗結果

2.11 限度設定和結果分析 為研究黃柏關黃柏摻偽或替代投料，擬定其限度，按照2.3項下方法制備供試品溶液，計算鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值，具體見表5。考慮不同產地黃柏和關黃柏藥材的區域性差異及樣品收集的局限性，以0.05為限度，即F值不得大于0.05[10]，可較好地區分上清丸中以關黃柏摻偽或替代正品黃柏投料。

表5 各樣品中A鹽酸巴馬汀/A鹽酸小檗堿比值的情況

取上清丸103樣品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，各精密吸取5 μL，注入HPLC中，計算鹽酸小檗堿的含量及鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值，結果見表6。各生產企業鹽酸小檗堿的含量統計圖如圖2所示，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值如圖3所示。

圖2 不同生產企業上清丸鹽酸小檗堿含量統計圖

圖3 不同生產企業上清丸鹽酸小檗堿含量統計圖

表6 103批次上清丸鹽酸小檗堿含量測定結果及比值

結果表明上清丸(大蜜丸)中鹽酸小檗堿含量差異較小，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均小于0.05，說明不同生產企業黃柏質量把關較嚴，均未出現關黃柏摻偽或替代投料的問題。上清丸(水丸)中鹽酸小檗堿與企業相關性較強，L企業鹽酸小檗堿含量較M和N企業低，但均未出現鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均大于0.05的情況。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 研究比較不同提取溶劑(60%乙醇、甲醇、鹽酸∶甲醇=1∶100)，不同提取方式(超聲20 min、40 min、60 min)，最終確定最佳提取條件是鹽酸∶甲醇(1∶100)超聲提取40 min。此條件提取較完全，通過上述色譜條件，可以較好地測定上清丸中鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀含量。

3.2 檢測波長的選擇 研究通過二極管陣列檢測器檢測，鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀在345 nm波長附近均最大吸收并參照中國藥典2020年版一部關黃柏含量測定項下的規定[12]，選擇345 nm為測定波長。

3.3 流動相的選擇 實驗在篩選流動相時，通過對乙腈-水、甲醇-水的運行，篩選出乙腈-水系統優于甲醇-水系統，但色譜峰出現了拖尾現象，進而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，但拖尾情況未完全解決。最后以乙腈-0.1%磷酸(加入磷酸二氫鉀使其達到0.02 mol/L)水溶液為流動相等度洗脫時，供試品中鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀達到基線分離，峰型較好，并且干擾較少，出峰時間適中，故選取此條件為流動相。

3.4 結果分析 通過測定103批上清丸中鹽酸小檗堿含量，上清丸(大蜜丸)中各企業樣品含差異較小，但同一企業各批次間含量差異較大，說明各批次間均一性較差。為了提高上清丸的一致性，相關企業應加強對投料黃柏的質量控制。上清丸(水丸)中L企業樣品較M、N企業低，說明L企業黃柏的質量較差，提示該企業應加強對黃柏質量的控制。在上清丸中關黃柏摻偽或替代投料檢查中，所有企業黃柏投料把關較嚴，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均小于0.05，未出現關黃柏摻偽或替代投料的情況。

實驗建立HPLC的方法測定上清丸鹽酸小檗堿的含量，對市售上清丸中關黃柏摻偽或替代黃柏投料進行檢查。所建立的方法操作簡單、結果準確，不同企業不同批次上清丸中鹽酸小檗堿含量存在一定差異，可能與制劑生產所用黃柏的產地、來源、采收季節以及原藥材批間質量差異等因素有關，提示相關生產企業關注黃柏原藥材質量及酒炒黃柏的工藝，不斷提高和完善上清丸的質量控制標準，確保上清丸質量穩定和臨床療效一致。