超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜法快速篩查測定抗疲勞類保健食品中112種化學(xué)藥

黃 芳，鄧 欣，張秋炎，周 熙，梁梓洋，徐翠芳，賴曉娜，羅輝泰，吳惠勤

（廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和人民消費潛力的提升，保健食品作為食品補充劑逐漸成為人們生活中的一種日常需求。然而，不少商家為了追求這類產(chǎn)品的快速效果，在其中非法添加化學(xué)藥，且添加量隨意，缺乏科學(xué)控制，一些有基礎(chǔ)病的消費者在不知情的情況下服用后產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，對生命安全造成威脅。近年來有關(guān)監(jiān)管部門對非法添加的監(jiān)管越來越嚴(yán)格，但不法分子制假售假行為也越來越隱蔽，通過添加補充檢驗方法以外的衍生物或類似物作為功效成分，且不直接在商品包裝上宣傳功效，用暗示的詞語或者在包裝盒里面介紹某些功能，從而逃避監(jiān)管。

國家食品藥品監(jiān)督管理局在2018 年發(fā)布的關(guān)于食品中那非類物質(zhì)的測定方法（BJS 201805）［1］中，規(guī)定了90種那非類物質(zhì)的篩查方法，該方法包括了以西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非為母體的大部分衍生物和合成副產(chǎn)物。該標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布以來對市場監(jiān)管起到一定作用，有效打擊了那非類非法添加現(xiàn)象。方法發(fā)布以來至2020年，筆者所在檢測機構(gòu)未在送檢產(chǎn)品中檢出非法添加，但近兩年發(fā)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)以外的衍生物和類似物檢出（例如2022年在產(chǎn)品中檢出的苯丙代卡巴地那非），可見原有的補充檢驗方法已相對滯后，需建立新的篩查檢測方法。

目前針對抗疲勞類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的檢測方法主要有薄層色譜法［2-3］、高效液相色譜法［4-6］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-14］。李啟紅［2］建立了補益類中藥及保健食品中非法添加西地那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非的薄層鑒別和表面增強拉曼光譜法（SERS）；魯藝等［3］建立了薄層色譜-高效液相色譜法對可能摻加硫代西地那非的中藥制劑及保健食品進行初步篩查，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行確證。范小龍等［4］建立了一種高效液相色譜同時測定保健食品中13 種那非類非法添加物質(zhì)的定性及定量分析方法。徐紅斌等［7］采用超高效液相色譜-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜用于減肥和壯陽類保健食品中32種非法添加藥物的快速篩查和確證；陳燕等［9］建立了QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蒸餾酒及其配制酒中90種那非類非法添加藥物的分析方法。夏金濤等［10］通過多種技術(shù)手段（UPLC-Q/TOF MS、UPLC-LTQ 等）篩查出固體飲料中一種新型的、結(jié)構(gòu)未知的非法添加卡巴地那非類似物（N-苯基丙氧苯基卡巴地那非）。綜合分析各文獻可見：單用薄層色譜法或液相色譜法的定性效果差，均需結(jié)合質(zhì)譜或拉曼光譜確證；質(zhì)譜法或高分辨質(zhì)譜成為主流的方法，液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜具有選擇性好、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點，但采用MRM采集模式只針對目標(biāo)成分，不能發(fā)現(xiàn)方法以外的可疑物，有漏檢的風(fēng)險。超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜法（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）綜合了高分辨質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜的雙重優(yōu)勢，既能準(zhǔn)確定性又能準(zhǔn)確定量。

本文采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜分析，建立了112種那非及雄激素類化合物數(shù)據(jù)庫，采用儀器自帶軟件篩查分析，能快速鑒定出保健食品中非法添加藥物，并針對檢出物采用一級母離子提取峰面積外標(biāo)法定量，準(zhǔn)確測定其目標(biāo)物的含量。該方法與現(xiàn)有文獻方法及補充檢驗方法對比具有以下優(yōu)勢：（1）分辨率高、選擇性強、定性定量準(zhǔn)確；（2）對采集的數(shù)據(jù)可再次分析，針對多出的可疑色譜峰進一步推測分子式，結(jié)合二級碎片離子信息及同位素信息推測結(jié)構(gòu)式，可發(fā)現(xiàn)新的添加物；（3）結(jié)合超高效液相色譜的高效便捷分離，優(yōu)于傳統(tǒng)液相方法，適用于復(fù)雜基質(zhì)的高選擇性、高通量篩查，還可以不斷地擴充數(shù)據(jù)庫中藥物種類和數(shù)量。本方法檢測目標(biāo)物已達(dá)112 種，比現(xiàn)有的補充檢驗方法多22種，鑒別的非法添加品種更全面。方法已用于實際工作，能更好地為企業(yè)提供原材料及成品的風(fēng)險監(jiān)控，可為政府監(jiān)管及第三方檢測機構(gòu)提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

112 種化學(xué)藥標(biāo)準(zhǔn)品（見表1，均購自阿爾塔公司）；甲酸（純度大于99%，麥克林試劑）；甲醇、乙腈（色譜純，默克公司）；水為屈臣氏蒸餾水。高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（Thermo公司）。

表1 112種化學(xué)藥的數(shù)據(jù)庫信息Table1 Database information of 112 compounds

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制112 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度為100 μg/L，用甲醇逐步稀釋，配制成0、1.0、2.5、5、10、25、50、75、100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液待用。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY BEH C18柱，（100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為乙腈；流速：0.2 mL/min；進樣量：1 μL。梯度洗脫條件：0～1 min，10% B；1～5 min，10%～40% B；5～10 min，40%～70% B；10～15 min，70%～95% B；15～17 min，95% B；17～17.1 min，95%～10% B；17.1～22 min：10% B。

質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧電離源（H-ESI 源），源區(qū)主要參數(shù)：正離子檢測模式（ESI+）噴霧電壓3 500 V，鞘氣流量35 Arb，輔助氣流量為7 Arb，毛細(xì)管（離子傳輸管）溫度320 ℃，蒸發(fā)溫度275 ℃。

建立化學(xué)藥數(shù)據(jù)庫的掃描方式為：一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描（Full MS-ddMS2），全掃描模式分辨率為6 000，掃描范圍為m/z100～1 500，二級掃描分辨率為15 000，強度閾值為50 000，分離窗口為1.5m/z，碰撞能量為30%、50%、70%。采集數(shù)據(jù)通過Freestyle 軟件提取化合物信息，并建立TraceFinder數(shù)據(jù)庫。

快速篩查的掃描方式為：一級質(zhì)譜全掃描。分辨率為6 000，掃描范圍為m/z100～1 500。采集數(shù)據(jù)通過TraceFinder設(shè)定母離子及保留時間（tR）。

1.4 樣品前處理

稱取待測樣品1 g（精確至0.01 g）（壓片糖果磨成細(xì)粉，咖啡直接取粉末，膠囊直接取內(nèi)容物，酒樣取液體），置于25 mL 具塞試管中，加入90%甲醇（含0.1%甲酸） 20 mL，渦旋5 min，超聲15 min，定容至刻度，待測。

1.5 定性、定量方法

采用一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描測定112 種化學(xué)藥物的對照品溶液，利用得到的一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間及二級質(zhì)譜圖及碎片離子信息，建立每個化合物的數(shù)據(jù)庫。

參照歐盟準(zhǔn)則2002/657/EC［15］高分辨質(zhì)譜對目標(biāo)化合物的鑒定要求，1個母離子和1個子離子、或2個子離子匹配，則可判定樣品中含有該化合物。對供試品溶液進行Full MS-ddMS2全掃描，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)篩查數(shù)據(jù)庫中m/z的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間對目標(biāo)化合物進行篩查。當(dāng)未知物保留時間在±0.2 min，且母離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，子離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差在10 ppm范圍內(nèi)時，可判定含有該化合物。再針對檢出的化合物，用母離子提取離子色譜峰面積為指標(biāo)，進行外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 可疑化合物的發(fā)現(xiàn)與鑒定

在實際樣品測試過程中發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩查結(jié)果為未檢出，但對比總離子流圖與空白樣品，發(fā)現(xiàn)有異常高的一個峰。對該峰進一步解析，其準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z464.219 6，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)推測該化合物的分子式為C26H29N3O5，二級質(zhì)譜圖（圖1A）中的主要特征碎片離子為m/z86.096 6、135.044 4、274.086 5、334.107 6，通過文獻檢索與比對［16-17］，并結(jié)合對照品，確認(rèn)該化合物為二乙氨基前他達(dá)那非（Diethylaminopretadalafil），結(jié)構(gòu)式見圖1B 所示，推測可能的質(zhì)譜裂解途徑如圖2 所示。其中，m/z86.096 6為母離子在C6與C7之間發(fā)生斷裂形成，且該途徑為二乙氨基前他達(dá)那非的主要裂解方式。子離子m/z334.107 6 則是母離子的9 號N 原子與C10 及C14 發(fā)生斷裂而形成，并進一步脫去CH3OH 與CO 而形成m/z274.086 5 離子，當(dāng)m/z334.107 6 在C10 與C26 發(fā)生斷裂時則形成了m/z135.044 4離子。

圖1 二乙氨基前他達(dá)那非的二級質(zhì)譜圖（A）與結(jié)構(gòu)式（B）Fig.1 MS2 spectrum（A） and structural formula（B） of diethylaminopretadalafil

圖2 二乙氨基前他達(dá)那非的質(zhì)譜裂解機理Fig.2 MS fragmentation pattern of diethylaminopretadalafil

2.2 數(shù)據(jù)庫的建立

采用“2.1”方法，對收集的112 種化學(xué)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ddMS2模式下進行分析，得到每個化合物的保留時間（tR）、母離子和子離子信息，建立供篩查的數(shù)據(jù)庫信息，見表1。

（續(xù)表1）

分析表1 中的化合物，主要為西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非類化合物、同系物及同分異構(gòu)體。其中西地那非類化合物根據(jù)取代基種類及取代位置的不同，又可分為西地那非類、紅地那非類、硫代西地那非類、卡巴地那非類、二硫代卡巴地那非類等，主要的質(zhì)譜裂解方式如圖3A所示，該類化合物可通過苯環(huán)上的C-Y與O-R3發(fā)生斷裂與重排，形成強度較高的碎片離子，包括西地那非和艾地那非的碎片離子m/z283.118 7，硫代西地那非的碎片離子m/z299.085 9。盡管該類化合物因取代基的不同導(dǎo)致質(zhì)譜裂解方式略有差異，但由于其母核結(jié)構(gòu)相同，該類化合物的質(zhì)譜裂解行為有著較高的相似度。

圖3 西地那非類（A）、伐地那非類（B）、他達(dá)那非類（C）化合物的主要裂解過程Fig.3 Fragmentation mechanisms of sildenafil or its analogues（A），vardenafil or its analogues（B） and tadalafil or its analogues（C）

伐地那非類化合物在結(jié)構(gòu)上與西地那非類化合物較為相似，包括伐地那非類、硫代伐地那非類和乙酰伐地那非類等。該類化合物的主要質(zhì)譜裂解方式如圖3B所示。因為與西地那非結(jié)構(gòu)類似，因此西地那非苯環(huán)上的裂解方式同樣存在于伐地那非類化合物中。由于伐地那非與西地那非的區(qū)別在于母核中氮原子位置的不同，因此兩類化合物由母核發(fā)生裂解所形成的碎片離子具有明顯差異，如伐地那非的碎片離子m/z151.086 6，可用于區(qū)分西地那非和伐地那非。

他達(dá)那非類化合物結(jié)構(gòu)上與西地那非及伐地那非相差較大，從結(jié)構(gòu)上主要分為含哌嗪二酮環(huán)與不含哌嗪二酮環(huán)兩種類型。從圖3C的質(zhì)譜裂解方式可以看出，這兩類他達(dá)那非類化合物有特征的碎片離子m/z135.044 1 和m/z262.086 2，其中m/z262.086 2 是由母核中心的含氮六元環(huán)發(fā)生裂解產(chǎn)生，而m/z135.044 1為母核中苯環(huán)處發(fā)生斷裂形成的3，4-（亞甲二氧基）甲苯正離子，可用于初步判斷是否屬于他達(dá)拉非類化合物。同時，在苯環(huán)處斷裂后亦可中性丟失1，2-亞甲二氧基苯，形成如他達(dá)那非的碎片離子m/z268.107 8。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

由于112 種化合物的理化性質(zhì)不同，因此選擇提取溶劑需綜合各化合物的極性及溶解性能。由于待測樣品大部分基質(zhì)為水溶性，在樣品中加入適量的水有利于提取。取空白樣品加標(biāo)后的提取溶劑提取并測試，以各化合物的一級提取離子峰面積為指標(biāo)，對比了甲醇、乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、90%甲醇（含0.1%甲酸）4 種提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，選擇90%甲醇（含0.1%甲酸）作為提取溶劑時，提取后溶液相對澄清，容易過濾，且各化合物的提取效果好，因此，實驗選擇其為最佳提取溶劑。實驗還考察了將樣品過Oasis HLB 固相萃取小柱的凈化方法，結(jié)果顯示過柱后部分化合物的回收率偏低，如脫硫伐地那非為44%，去甲基他達(dá)拉非為58%?？紤]到儀器的高靈敏性能，樣品稀釋后進樣也能達(dá)到足夠檢出限，因此選擇直接提取法更簡單實用。

2.4 液相色譜條件的優(yōu)化及同分異構(gòu)體的處理

考察了多個因素對色譜分離、靈敏度和離子化效率的影響。由于所測112 種化合物含有14 對同分異構(gòu)體，比較了乙腈、甲醇、水、0.1%甲酸不同組合作為流動相，以不同梯度在ACQUITY BEH C18色譜柱上的分離效果。結(jié)果顯示，在甲醇-水和乙腈-水中，均有多對同分異構(gòu)體未能完全分離，在乙腈-水中加入0.1%甲酸，大部分物質(zhì)的靈敏度均有提高，且峰形改善，因此實驗最終選擇乙腈和0.1%甲酸水作為流動相組成。

112 種化學(xué)藥中14 組同分異構(gòu)體的精確分子離子和同分異構(gòu)體化合物個數(shù)分別為：m/z434.171 0（2 個）、m/z467.276 5（3 個）、m/z489.227 9（5 個）、m/z453.260 9（2 個）、m/z505.222 8（3 個）、m/z521.199 9（2 個）、m/z475.212 2（2 個）、m/z461.196 6（3 個）、m/z519.220 7（2 個）、m/z438.250 0（2個）、m/z505.205 0（3個）、m/z517.259 2（2個）、m/z460.201 3（2個）、m/z835.301 4（2個），其中精確離子為m/z489.227 9的同分異構(gòu)體有5個，試驗了不同流動相體系和色譜條件均未能達(dá)到完全分離（見圖4A），保留時間7.88 min 的色譜峰中存在兩個化合物（異丁基西地那非和丙氧基苯基西地那非），其二級質(zhì)譜圖中有不同的特征碎片離子，可根據(jù)二級質(zhì)譜進一步定性鑒定。其余13組均能達(dá)到分離，部分同分異構(gòu)體的提取離子圖見圖4（A-J）所示。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正、負(fù)離子同時采集模式下，112 種化合物中大部分化合物的分子離子峰在正離子模式下的響應(yīng)值較高，因此方法采用正離子掃描。對比一級全掃描與目標(biāo)物二級掃描方式下的靈敏度發(fā)現(xiàn)，一級全掃描方式的靈敏度較高。因此，采用全掃描方式進行定量分析。對于在同樣保留時間下篩查到的目標(biāo)離子，通過二級譜圖進行定性分析。對比不同碰撞能量下化合物的二級譜圖發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)化合物在30、50、70 eV下得到其特征性二級碎片。在該碰撞能下采集化合物的二級質(zhì)譜圖。由于色譜柱的粒徑較小，色譜峰峰寬較窄（約0.1 min），為盡可能獲得目標(biāo)物的二級質(zhì)譜圖，采用動態(tài)排除方法進行dd-MS2掃描。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 檢出限、定量下限與線性范圍分別采用溶劑和空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)曲線，以質(zhì)量濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)比值 = 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，計算基質(zhì)效應(yīng)比值。結(jié)果表明，有6 種成分的基質(zhì)效應(yīng)明顯。因此，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法定量以抵消基質(zhì)引起的定量誤差。

用咖啡陰性樣品提取液做溶劑，配制一定質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/L）的系列基質(zhì)加標(biāo)溶液，從低至高進樣，以化合物呈明顯色譜峰的最低濃度為檢出限（LOD），以化合物在線性范圍中滿足回收率在80%～120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度為定量下限。結(jié)果表明，112種化合物的檢出限為0.012 5～0.062 5 mg/kg，定量下限為0.025～0.125 mg/kg。

用甲醇做溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10、25、50、75、100 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察各成分的線性范圍。按實際情況選取5 個濃度點計算，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，母離子提取離子流圖的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線及對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（r2），各成分的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999。表明方法的線性關(guān)系良好，滿足定量分析的要求。

2.6.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差用咖啡做基質(zhì)，在低（10 μg/L）、中（25 μg/L）、高（50 μg/L） 3 個加標(biāo)濃度下測試回收率，每個加標(biāo)水平測定6次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。方法的回收率為62.0%～124%，RSD 為2.4%～8.9%。將加標(biāo)溶液進行數(shù)據(jù)庫篩查，所有成分均能匹配檢出，準(zhǔn)確率達(dá)100%。實驗分別采用壓片糖果、膠囊和保健酒做基質(zhì)，考察加標(biāo)回收率，測得回收率為78.4%～122%，方法能滿足定量要求。

2.7 實際樣品的測定

近2 年檢測了客戶送檢的抗疲勞類樣品近150 個，樣品類型有壓片糖果、膠囊、保健酒、咖啡等，部分陽性樣品的測定結(jié)果見表3。檢出成分有育亨賓（Yohimbine）、二乙氨基前他達(dá)拉非（Diethylamino pro-tadalafil）、苯丙代卡巴地那非（Carbodenafil impurity 7）等，其中檢出頻率最高的是苯丙代卡巴地那非，由此可見此類物質(zhì)非法添加現(xiàn)象仍然存在。

表3 部分典型陽性樣品的測定結(jié)果Table 3 Detection results of some typical positive samples

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本文采用酸性有機混合溶劑超聲提取樣品，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS法對保健食品中的非法添加化學(xué)藥進行快速篩查測定，可準(zhǔn)確測定112 種非法添加化合物。對全掃描數(shù)據(jù)再次分析，還可發(fā)現(xiàn)其它可疑色譜峰，推測其分子式，并結(jié)合二級碎片離子信息及同位素信息可推測結(jié)構(gòu)式，發(fā)現(xiàn)新的非法添加物。方法適用于抗疲勞類保健食品及普通食品中非法添加化學(xué)藥的快速篩查。