一步式QuEChERS結合液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜同時篩查與分析生牛乳中153種獸藥殘留

仝凱旋，常巧英，謝瑜杰，吳興強，范春林，陳 輝

（中國檢驗檢疫科學研究院，國家市場監管重點實驗室（食品質量與安全），北京 100176）

在奶牛養殖過程中，獸藥被用于保護牲畜免受真菌或疾病的侵害［1］。根據聯合國糧農組織的數據，2018 年全球牲畜數量已達到312 億頭［2］。正確使用獸藥可有效促進牲畜生長，但一些不法分子為追求利益，亂用和濫用藥物使其在動物體內積累，對牛奶質量、工藝特性、乳制品質量有不良影響。而一些獸藥具有熱穩定性，很難通過熱處理完全破壞［3］，其可通過牲畜轉移到食物鏈中，人們長期食用含獸藥殘留的奶制品會對人體產生潛在毒性作用。為了保障消費者的合法權益，中華人民共和國農業農村部制定了畜產品中獸藥殘留的嚴格監管制度［4］。但獸藥種類繁多，并且國家制定食品中獸藥最大殘留限量（MRL）越來越低，因此實現不同類別獸藥高通量快速檢測越來越富有挑戰性［5］。

對于獸藥多殘留分析，液相色譜-高分辨質譜（LC-HRMS）數據采集和數據開發技術的進步使其成為篩選各種小分子危害污染物的有力工具。目前已有多種篩查和定量方法被報道，包括使用液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（LC-Q TOF/MS）［2，6-7］和LC-Q Orbitrap/MS［1，8-9］。HRMS 使用高靈敏度的全掃描采集模式，加上高分辨率（＞50 000 FWHM）和高質量精度（＜5 ppm），使其在多類化合物分析和回顧性分析上具有獨特的優勢［10］。Sun等［1］基于LC-Q Orbitrap/MS 報道了一種集合數據依賴采集和數據獨立采集的方法，將該方法分別應用于牛奶、番茄和玉米中農藥、獸藥、真菌毒素的快速測定，對比其他采集方法，該方法具有更高的重現性，并可以有效降低假陽性結果。在使用強大分析工具的同時，還要開發高效和廣泛的前處理技術降低基質干擾和儀器的損耗，QuEChERS 方法應用范圍廣泛，可用于非極性到強極性目標化合物的樣品制備。Desmarchelier 等［11］將QuEChERS 技術成功應用于動物原料中獸藥多殘留的驗證，驗證的105 種獸藥假陰性率和假陽性率均低于5%。Zhang 等［12］報道了改進的QuEChERS 方法提取牛奶中90 種獸藥，并將該方法應用于不同類型牛奶樣品。一步式QuEChERS 方法可以通過全自動儀器快速完成樣品前處理，且平行性好，Wang等［13］已將該方法應用于農藥多殘留篩查中。目前食品監測技術的趨勢是將各類污染物組合到一個程序中，因此開發高分辨質譜同時篩查和定量多類獸藥的檢測方法具有重要意義。

本研究旨在建立一種改進的QuEChERS 前處理方法，對緩沖液、提取液、萃取鹽和凈化填料進行優化，并在此基礎上使用一步式QuEChERS 前處理系統結合LC-Q Orbitrap/MS 實現生牛乳中15 類153種獸藥的快速篩查與確證。對該方法的篩查限、定量下限、基質效應、回收率和精密度進行驗證，結果令人滿意，方法已成功應用于實際生牛乳樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜-Q-Exactive靜電場軌道阱高分辨質譜聯用儀（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；N-EVAP112 氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）；SR-2DS 型水平振蕩器（日本TATEC 公司）；KDC-40 低速離心機（中國安徽中佳公司）；SiO-6512 QuEChERS自動樣品制備系統（北京本立科技有限公司）。

153 種獸藥標準物質（天津阿爾塔科技有限公司），純度均大于95%，其中磺胺類獸藥27 種，喹諾酮類25種，皮質類固醇類22種，咪唑類16種，受體激動劑類14種，殺蟲劑類10種，大環內酯類7種，生物堿類5種，酰胺醇類5種，四環素類3種，丁酰苯類2種，吩噻嗪類2種，喹喔啉類1種，苯二氮卓類1 種，其他類獸藥13 種；甲醇、乙腈、甲苯（色譜級，上海安譜實驗科技有限公司）；甲酸、乙酸銨（質譜級，美國Honeywell公司）；C18、PSA、Z-sep（美國Agilent Technologies）。

1.2 標準溶液的配制

購買的標準品有粉末或標準溶液，固體標準品需稱取適當質量，根據各類獸藥的性質用不同溶劑超聲溶解后配制成1 000 mg/L標準儲備液，置于4 ℃冷藏避光保存。移取適量標準儲備液用甲醇、乙腈或水稀釋成10 mg/L的混合標準工作液，于4 ℃冷藏避光保存。

1.3 提取與凈化

一步式QuEChERS 樣品制備過程如下：稱取樣品2 g（精確至±0.01 g），置于整合套管中，加入6 mL Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液、10 顆鋯珠、10 mL 1%乙酸乙腈、4 g 無水硫酸鈉、1 g 氯化鈉，將含900 mg無水硫酸鈉、30 mg PSA和90 mg C18的整合套管內管擰好后，按重量對稱放入QuEChERS自動樣品制備系統中，設置振蕩轉速4 000 r/min，離心轉速4 500 r/min，時間300 s，重復2次。程序運行完畢后取內管2 mL 上清液于干凈試管中，氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水溶液（50∶50，體積比）定容，超聲混勻，經0.2 μm濾膜過濾后，待測。

1.4 液相色譜-質譜條件

Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm，Agilent Technologies）色譜柱；柱溫30 °C，進樣量5 μL；流動相A 為0.1%甲酸水溶液；B 相為乙腈；梯度洗脫程序： 0 min：2% B；0～1.8 min：2%～15% B；1.8～3.5 min：15%～20% B；3.5～6 min：20%～25% B；6～7 min：25%～30% B；7～11 min：30%～35% B；11～13.5 min：35%～55% B；13.5～16 min：55%～85% B；16～20 min：85%～100% B；20～25.1 min：100%～2% B；25.1～28 min：2%～0% B；流速為0.5 mL/min。

正離子模式：噴霧電壓：3 kV；毛細管溫度：325 ℃；加熱器溫度：350 ℃；鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb；負離子模式：噴霧電壓：-2.5 kV；毛細管溫度：325 ℃；加熱器溫度：350 ℃；鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb。

掃描模式：Full MS/dd-MS2；掃描范圍：m/z80～1 100；一級全掃描：分辨率70 000 FWHM，C-trap最大容量（AGC target）為1×106，C-trap最大注入時間為200 ms；數據依賴二級子離子掃描（dd-MS2）：分辨率：17 500 FWHM，C-trap 最大容量（AGC target）為2×105，C-trap 最大注入時間為100 ms；循環次數：5；歸一化碰撞能量：20%、40%、60%；動態排除：8 s。153 種獸藥的名稱、保留時間（tR）、CAS號、加和離子形式、定量及定性離子精確質量數等信息見表1。

表1 生牛乳中153種獸藥的質譜特性及驗證結果Table 1MS characteristics and validation results of 153 veterinary drugs in raw milk

1.5 方法驗證

使用TraceFinder 軟件對樣品的加合離子和二級碎片離子的精確質量和保留時間與自建精確質量數據庫進行匹配，保留時間偏差介于±0.5 min，離子質量數偏差介于±5 ppm，需至少加合離子和1 個碎片離子檢出，方滿足定性篩查要求；使用基質匹配標準曲線外標法進行定量分析。根據EU/2021/808歐盟法規對篩查和定量方法進行驗證［14］。對于篩查方法，可基于定性方法中的SDL 建立一定濃度水平上目標分析物的置信度，基本的驗證應該包括對20個加標樣品進行分析，其中至少95%的樣品中檢測到分析物的最低添加水平即為該分析物的篩查限（SDL）。定量下限（LOQ）是回收率和精密度均令人滿意時的最小加標濃度。通過對空白基質做10 點標準曲線，涵蓋所有化合物線性范圍，最終選取5 點標準曲線以線性系數（r2）評估其線性關系。為評估方法的準確度和精密度，在1倍LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ 3個加標水平下進行6組回收率實驗。

2 結果與討論

2.1 緩沖液pH值優化

油水分配系數（logP）是表征化合物溶解度的重要參數，是基于土壤吸附系數歸一化到有機碳含量（logKoc）的模擬值［15］，logP值越小表明該化合物極性越強，水溶性越好，各類獸藥化合物的logP值從Chemispider 網站查詢（圖1）。結果顯示，超過90%的磺胺類和喹諾酮類獸藥的logP＜2，因此考慮加入適量水提高各類獸藥的提取效率。加入緩沖溶液不僅可以引入水體系，還可通過調節pH 值改變獸藥的電離狀態，影響其在有機相中的分配，因此緩沖溶液是更優的選擇。Na2EDTA-McIlvaine作為緩沖溶液時可阻止四環素、喹諾酮類藥物與金屬離子的絡合作用，從而提高獸藥回收率［16］。本研究采用Na2EDTA-McIlvaine作為緩沖液，并優化了pH 值為4.0、7.0、9.0時的提取效率。如圖2所示，緩沖液pH 4.0時目標獸藥符合回收率（REC）要求的個數最多，其中吩噻嗪類藥物中的異丙嗪、氯丙嗪，磺胺類藥物中的酞磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶等，喹諾酮類藥物中的沙拉沙星、司帕沙星等獸藥在低pH 值下的回收率效果更好，而其他幾類獸藥的回收率受pH 值的影響不明顯。方法的精密度在3 個pH 值下符合要求（RSD≤20%）的獸藥個數相當，綜合考慮選擇pH 4.0為最優酸堿度。

圖1 153種獸藥化合物的logP值Fig.1 logP values of 153 veterinary drug compounds

圖2 不同緩沖液pH值對獸藥回收率及相對標準偏差（RSD）的影響Fig.2 Effects of different buffer pH values on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.2 萃取溶劑體積優化

由于前處理過程中需要同時萃取不同理化性質的獸藥化合物，因此萃取溶液需具有通用性。Abdallah 等［17］對一系列獸藥殘留萃取溶劑進行萃取實驗，發現乙腈對多類獸藥的萃取效果最好，甲醇的萃取效果最差。在乙酸等改性劑的作用下，乙腈有良好的親水親脂性，同時還有沉淀蛋白的作用，不加入乙酸會提高樣品中游離磺胺類藥物的提取效率，但會導致喹諾酮類藥物的回收率降低［18］。Zhang 等［12］研究發現萃取溶劑加入乙酸后會通過影響多類獸藥的電離，從而影響萃取效率，且以乙腈中加入1%乙酸酸化后的萃取效果最好。因此，本研究使用1%乙酸酸化乙腈作為萃取溶劑，并對比不同萃取溶劑體積（10、16、20 mL）對獸藥回收率的影響，結果發現溶劑體積為10 mL 時效果最佳，符合回收率要求的獸藥占比為83.7%，高于其余兩種溶劑體積（73.2%和76.5%），并且在50 μg/kg 的加標水平下，萃取溶劑體積降低會使單位體積獸藥濃度增大，上機濃度隨之增大，出峰峰形更佳，從綠色環保的角度最終選擇10 mL的1%乙酸酸化乙腈作為最佳萃取溶劑。

2.3 緩沖鹽種類優化

用乙腈萃取時可能會在水相和有機相之間產生二元相［19］，需加入萃取鹽使兩相分層并盡可能除去有機相中的水分。在最初的QuEChERS 方法中使用MgSO4和NaCl，但鎂鹽會誘導喹諾酮類藥物的鰲合作用，因此采用Na2SO4代替MgSO4，同時對比了3 類常用萃取鹽組合：傳統QuEChERS組合（4 g Na2SO4+1 g NaCl），AOAC 組合（6 g Na2SO4+1.5 g 乙 酸 鈉），EN 鹽 組 合（4 g Na2SO4+1 g NaCl+1 g 檸檬酸三鈉+0.5 g 檸檬酸二鈉）的萃取效果（見圖3）。結果顯示，EN 鹽組合對于各類獸藥的回收效果最好，128 種獸藥的回收率在70%～120%范圍內，這是由于引入檸檬酸鹽后進一步提高了緩沖作用。Desmarchelier 等［11］的研究也表明不加入檸檬酸鹽的情況下，奶粉提取液中的乙腈相會形成凝膠，不利于下一步操作，實驗最終選擇EN鹽組合作為萃取鹽。

圖3 不同萃取鹽組合對獸藥回收率及相對標準偏差的影響Fig.3 Effects of different extraction salting-out agents on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.4 凈化填料優化

生牛乳是較為復雜的基質，含有大量脂質、蛋白質及其他干擾物質，因此在儀器分析前需進行凈化，降低基質對儀器的損耗［20］。一些傳統的吸附劑對各種基質的凈化效果很明顯，例如PSA 可有效去除有機酸和糖類，C18可去除脂類，Z-sep 是一種基于氧化鋯基的新型吸附劑，可用于去除脂肪基質中的疏水化合物。本實驗主要針對上述3種凈化填料的組合進行優化。首先對Z-sep的量進行優化，比較了Z-sep 用量為0、15、30、60 mg時獸藥的回收率（如圖4）。結果顯示，不使用Z-sep 作凈化填料時獸藥的回收效果最好，有131 種獸藥回收率在70%～120%范圍內，隨著Z-sep 用量的逐漸增加，回收率合格的獸藥數量逐漸減少，這是由于Z-sep 在吸附雜質的同時對部分獸藥也有一定的吸附效果。對于不同取代基的目標化合物，Z-sep 吸附劑的親和能力不同，取代基和吸附劑相互作用強弱可按如下排序：氯化物＜甲酸鹽＜乙酸鹽＜硫酸鹽＜檸檬酸鹽＜氟化物＜磷酸鹽＜氫氧化物［21］。圖5A 和B 分別為Zsep 使用量為0、30 mg 時馬波沙星和沙拉沙星的提取離子流色譜圖（EIC）圖，結果顯示隨著Z-sep 的加入，兩種獸藥的響應強度明顯降低。這是由于這兩種喹諾酮類藥物含有多個—F 和—OH 鍵，使得Z-sep 對此類藥物的吸附性過強，導致回收率降低。隨著Z-sep 用量的增加，馬波沙星的回收率從82.7%降至23.4%，沙拉沙星從90.8%降至26.0%。為提高整體獸藥的回收率，最終考慮不使用Z-sep作為凈化填料。

圖4 不同Z-sep用量對獸藥回收率及相對標準偏差的影響Fig.4 Effects of different Z-sep dosages on the recoveries and RSDs of veterinary drugs

圖5 未使用Z-sep（A）及使用30 mg Z-sep（B）時馬波沙星和沙拉沙星的EIC圖Fig.5 EIC diagrams of marbofloxacin and sarafloxacin without Z-sep（A） and with 30 mg Z-sep（B）

進一步優化不同PSA（0、30、60、90 mg）和C18（30、90、150、200 mg）用量對生牛乳的凈化效果和獸藥加標回收率情況（圖6）。結果顯示，PSA 為30 mg 時可使132 種獸藥的回收率在70%～120%范圍內，減少或增加PSA 用量均會降低獸藥滿意回收率的數量；回收率在70%～120%范圍內的獸藥數量則隨C18用量的增加而增多，當C18為90 mg 時達到峰值。溶劑樣品和提取后加標樣品之間的響應差異被稱為絕對基質效應。進一步考察方法的絕對基質效應，結果顯示，生牛乳主要表現為基質抑制，不同PSA 用量中，30 mg PSA 的效果最佳，有73.6%的獸藥基質效應在±20%以內；不同C18的用量中，90 mg C18效果最佳，有78.9%的獸藥基質效應在±20%以內，回收率與基質效應規律一致，表明該凈化填料組合的凈化效果最優。因此，實驗最終選用30 mg PSA 和90 mg C18用于后續實驗。

圖6 PSA（A）及C18（B）用量對獸藥回收率及基質效應的影響Fig.6 PSA（A） and C18（B） amounts on recoveries and matrix effects of veterinary drugs

2.5 基質效應

基質效應（ME）是由共萃取物對目標化合物的電離作用引起，對于各類化合物基質效應的研究表明，基質抑制或增強常常伴隨著分析方法的精密度顯著下降［22］，如果不采取抵消措施，基質效應會影響方法的準確性?；|效應的評價公式為：- 1)×100%，當|ME|≤20%時表現為弱基質效應，20%＜|ME|≤50%時表現為中等基質效應，|ME|＞50%時表現為強基質效應［23］。本研究采用基質匹配標準曲線法進行基質效應評價，磺胺類、皮質類固醇類獸藥主要表現為基質抑制效應，喹諾酮類則主要表現為基質增強效應。所考察的獸藥中，84.8%的獸藥表現為弱基質效應，10.5%的獸藥表現為中等基質效應，其中主要包括磺胺二甲嘧啶、磺胺異唑等磺胺類藥物，另有4.7%的獸藥表現為強基質效應，表明本方法可有效降低基質效應的干擾，增強分析方法的精密度。

2.6 方法學驗證

在優化條件下，按“1.5”考察生牛乳中153 種獸藥的SDL 和LOQ。結果顯示，153 種獸藥的SDL在0.1～20 μg/kg 范圍內，其中超過87.6%的獸藥SDL 小于5 μg/kg；153 種獸藥的LOQ 在0.1～20 μg/kg范圍內，其中86.9%的獸藥LOQ 小于5 μg/kg。Chen 等［24］結合LC-MS/MS 建立了SPE 方法測定生牛乳等基質中120種獸藥殘留，所有藥物的LOD 和LOQ 分別為0.5～3.0 μg/kg和1.5～10.0 μg/kg；Deng等［25］使用LC-Q TOF/MS 建立了牛奶中105 種獸藥的篩查和定量方法，其LOD 和LOQ 分別為0.01～5.96 μg/kg和0.04～18.45 μg/kg。本研究所建立的篩查和定量方法限量較低，有著令人滿意的靈敏度，且全部化合物的靈敏度滿足GB 31650-2019中奶類靶組織的最大殘留限量要求（見表1）。

通過對生牛乳樣品在0.1～200 μg/kg 范圍內進行加標，利用基質匹配校準曲線方法計算線性關系，各化合物線性范圍見表1，結果表明全部獸藥的r2均在0.99 以上。以1 倍LOQ、2 倍LOQ 和10 倍LOQ的加標水平對生牛乳基質進行6 次重復驗證，得到回收率和重復性結果，3 個加標水平下的回收率在70%～120%范圍內獸藥占比分別為92.8%、94.1%和94.8%，且RSD 均在20%以下，表明該方法有令人滿意的準確度和精密度。

2.7 實際樣品檢測

為進一步驗證該方法的實用性，使用最優方法對中國不同省份的32 批生牛乳真實樣本進行檢測，有12批次生乳樣品檢出孕酮，含量范圍為10.5～21.3 μg/kg。

3 結 論

采用一步式QuEChERS 樣品前處理技術結合LC-Q Orbitrap HRMS 建立了生牛乳中15 類153 種獸藥的快速篩查與定量的高通量方法。該方法可在一個套管中完成樣品的提取和凈化，縮短了前處理時間，提高了樣品前處理的平行性。對樣品前處理條件進行優化，并在最優條件下對方法的篩查限、定量下限、回收率和相對標準偏差進行驗證。本研究最大限度地減少了人工參與，方法簡單直接，具有很強的實際應用價值。