改進的QuEChERS/氣相色譜-靜電場軌道阱質譜法測定牛乳中的71種農藥殘留

張申平，周 靜

（上海市質量監督檢驗技術研究院 國家市場監管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監控技術），上海 200233）

牛奶是鈣和優質蛋白質的良好來源，重視牛奶在飲食中的健康促進作用已成為全球共識，人們在關注牛奶營養的同時對牛奶中農藥殘留等有害物質的關注度也越來越高。農藥通過食物鏈蓄積，可能會對生物體的生理、免疫功能產生影響，并可能致畸、致癌、致基因突變［1-3］。牛奶中殘留的農藥主要來自飼草料、飲水、圈舍消毒、奶牛寄生蟲、真菌、細菌防治用藥，尤其在圈舍中使用的農藥易污染擠奶設備，導致殘留的農藥進入牛奶原料乳。歐盟、日本、美國、澳大利亞等國家或地區持續關注牛奶中的農藥殘留情況，并不定期修訂牛奶中農藥的最大殘留限量值（MRLs），限量值愈發嚴格［4-5］。我國《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》GB 2763 標準歷經5 次修訂，對牛乳中農藥殘留的限量種類逐步增加，2014 版僅規定了奶中狄氏劑的殘留限量，2019 版制定了牛乳中116 種農藥的最大殘留限量值，2021 版將牛乳中農藥殘留限量擴展至139 種。同時GB 2763-2021［6］對牛乳中滅線磷的限量值低至0.01 mg/kg，特丁硫磷低至0.01 mg/kg，氯丹低至0.002 mg/kg，限量值的嚴格程度逐步趨向發達國家和地區。但GB 2763-2021規定的牛乳中139種農藥殘留，僅67種農藥指定了檢測方法，50%以上的農藥缺乏標準檢測方法。

我國發布的測定牛乳中農藥多殘留的標準方法是GB/T 23210-2008［7］《牛奶和奶粉中511種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》，但由于GC-MS 的靈敏度較低，加之基質效應的影響導致部分農藥的檢出限難以滿足GB 2763-2021的限量值要求。文獻報道的牛乳中農藥殘留檢測主要采用三重四極桿串聯質譜，結合固相萃取小柱凈化［8-9］、低溫冷凍液液萃取［10-11］、分散固相萃取［12］、凝膠滲透［13］和QuEChERS［14-16］等前處理方法。其中QuEChERS法具有操作簡單、快速高效等優點，適用于快速處理大批量農藥多殘留樣品。雖然現行標準方法和文獻中多采用乙腈處理牛乳樣品，在沉淀蛋白質的同時可降低提取液中的脂肪含量，但牛乳富含蛋白質、脂肪、糖類、磷脂，且農藥殘留量低，進入提取液中的少量脂肪仍會影響測定，導致基質效應較強。因此，開發牛乳中農藥多殘留的檢測方法，明確各種農藥的基質效應對于研究牛乳中農藥殘留現狀具有積極的現實意義。

靜電場軌道阱高分辨質譜可以區分基質中的雜質和色譜共流物，有利于痕量化合物的分析，降低了對樣品前處理的要求，利用全掃描（Full MS）模式采集的數據文件可開展回顧性數據分析。本文在前期研究的基礎上［17］，針對GB 2763-2021對牛乳中農藥殘留的限量情況，選取在毛細管色譜柱上有較好保留能力的71 種農藥（包括吡唑萘菌胺、氟啶蟲胺腈等未指定檢測方法的農藥），采用改進的QuEChERS 凈化結合氣相色譜-靜電場軌道阱質譜（GC-Exactive Orbitrap MS）法對牛乳中上述71 種農藥進行定量篩查，為保障乳品質量安全提供了技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-靜電場軌道阱質譜、TG-5Sil MS 氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Thermo Fisher公司）；PL2002電子天平（精度0.01 g，瑞士Metter Toledo 公司）；MS104S電子天平（精度0.000 1 g，瑞士Metter Toledo 公司）；Reax Control 渦旋振蕩器（德國Heidolph 公司）；Centrifuge 5804 離心機（德國Eppendorf公司）。

71 種農藥標準品（100 mg/L，乙腈或甲醇）購自天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）（40～60 μm，美國Dikma 公司）；正構烷烴（1 000 mg/L，C7～C40，北京曼哈格生物科技有限公司），微孔濾膜（0.22 μm，上海普譽科貿有限公司）。

供試樣品：巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、高溫殺菌乳、調制乳購于上海市徐匯區的多個超市。

1.2 標準溶液的配制

混合標準溶液：將71 種農藥標準品分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，移取一定量各農藥標準溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮-正己烷（體積比1∶1，下同）定容成2 mg/L的混合標準溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

內標溶液：準確稱取外環氧七氯，用丙酮-正己烷溶解定容并逐級稀釋為10 mg/L 的內標溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

空白基質標準溶液：準確吸取適量混合標準溶液，用空白樣品的提取液配成系列標準溶液，現配現用。

1.3 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）牛乳樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 1.0%（體積分數）甲酸-乙腈、4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g 氯化鈉及1 顆陶瓷均質子，以300 r/min 振搖10 min，在-20 ℃冰箱中冷凍20 min，以4 000 r/min 離心2 min，轉移全部上清液至含有1.0 g無水硫酸鎂、400 mg C18和100 mg PSA 的離心管中，渦旋混勻5 min，以4 000 r/min 離心2 min。準確吸取2 mL 凈化后的上清液至15 mL 離心管中，40 ℃下氮吹至近干，用丙酮-正己烷溶解定容至1 mL，加入10 μL內標溶液，混勻并經0.22 μm濾膜過濾后測定。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：TG-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min 升至90 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持1.5 min，以5 ℃/min 升至280 ℃，再以10 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速：1.20 mL/min；進樣口溫度：300 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.4.2 質譜條件電子轟擊源：70 eV；傳輸線溫度：260 ℃；離子源溫度：280 ℃；溶劑延遲：5 min；掃描模式：Full MS。每個農藥選取3 個特征碎片離子，選取其中信號最強的離子作為定量離子，其余作為定性離子。

2 結果與討論

2.1 樣品提取條件的優化

GB 2763-2021規定了牛乳中有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、雜環類等極性和溶解度差異較大的多種類農藥的最大殘留限量值，因此提取溶劑需能兼顧對多種農藥的提取效果。比較了乙腈［18-19］、丙酮［20］、正己烷［21］、乙酸乙酯［22-23］、甲醇［24］、酸化乙腈［14］、酸化甲醇［25］、乙腈-水［10］等提取溶劑對多種農藥的提取效果，正己烷、丙酮多用于有機氯農藥的提取，乙酸乙酯對滴滴涕（59.1%）、聯苯菊酯（62.5%）的提取效率較低［20］，甲醇對六六六（57.4%）的提取效率較低［24］。相比而言，乙腈對滴滴涕（88.1%）和六六六（93.7%）的提取效率較高［17］，同時乙腈可充分沉淀牛乳中的蛋白質，且對牛乳中脂質等雜質的溶解度低，可有效地降低樣品雜質對儀器的污染。雖然大部分研究中以乙腈或酸化乙腈作為提取溶劑，但根據待測農藥種類的不同，乙腈中加入甲酸、乙酸、三氯乙酸［7］的體積分數有所不同。實驗考察了甲酸（FA）體積分數分別為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%的乙腈（ACN）溶液對牛乳中71種農藥的提取效果（表1）。結果顯示：當甲酸的體積分數為0.1%和0.5%時，農藥的回收率均較低，當甲酸的體積分數增至1.0%時，農藥的回收率明顯增加，回收率在80%～120%之間的農藥達到57個。但當甲酸的體積分數繼續增加時，牛乳中其他雜質的質子化幾率也隨之增加，導致基質增強效應較強，當甲酸的體積分數為2.0%時，回收率大于120%的農藥達到23 個。根據王敬等［4］的報道，在提取過程中加入斜切面柱狀陶瓷均質子能有效防止樣品結塊，增加提取溶劑與樣品的接觸面積。本實驗最終采用1.0% 甲酸-乙腈為提取溶劑，同時加入1顆陶瓷均質子以提高農藥的提取效果。

表1 不同體積分數的甲酸-乙腈對牛乳中71種農藥的提取效果（n=3）Table 1 Spiked recoveries of 71 pesticides in milk extract with different volume fraction formic acid-acetonitrile solvents（n=3）

2.2 樣品凈化條件的優化

QuEChERS 法利用吸附劑與樣品提取液中雜質的相互作用除去提取液中的雜質，達到減弱基質效應的目的［26］。常用的凈化劑有C18、PSA、石墨化碳黑（GCB）、無水MgSO4。PSA 和C18可除去牛乳中的脂肪、有機酸、糖類等物質，GCB 對色素和某些平面結構化合物具有吸附作用，無水MgSO4可降低提取液中水的含量，減少水分對毛細管色譜柱的影響。在實驗過程中發現存在較強的基質增強效應，導致部分農藥的回收率大于120%，因此考慮使用C18、PSA 降低基質效應的影響。當僅使用C18時，農藥的回收率見圖1，C18用量由200 mg 增至400 mg 時，回收率大于120%的農藥個數明顯減少，回收率為80%～120%的農藥增至61個；但當C18用量進一步增至500 mg時，可能由于過量的C18會吸附農藥，使得32個農藥的回收率低于80%。因此確定C18的用量為400 mg，在此基礎上考察了PSA 用量對農藥回收率的影響（圖2）。發現當PSA 的用量為100 mg 時，回收率處于80%～120%之間的農藥個數最多，達到60個；當進一步增加PSA 的用量時，會出現與C18相同的過度吸附情況。無水MgSO4的用量參考GB/T 23210-2008［7］，當稱樣量為5.0 g 時，無水MgSO4的用量為1.0 g。因此，實驗確定向提取液中加入400 mg C18、100 mg PSA、1.0 g無水MgSO4，并立即渦旋混勻。

圖1 C18用量對71種農藥回收率的影響（n=3）Fig.1 Effect of C18 dosage on recoveries of 71 pesticides （n=3）

圖2 C18用量為400 mg時PSA用量對71種農藥回收率的影響（n=3）Fig.2 Effect of PSA dosage on recoveries of 71 pesticides with 400 mg C18（n=3）

2.3 質譜參數的確定

信息完善的質譜數據庫對化合物定性至關重要。歐盟EC/657/2002 關于質譜定性要求每個化合物必須具有4 個確證點（IP），高分辨質譜對精確質量數進行全掃描測定，每個離子可被定義為2 個確證點，1 個定量離子和1 個輔助定性離子的確證點即可達到4 個，從而實現同時定量和定性確證［27-28］。

靜電場軌道阱高分辨質譜Full MS 模式采集的數據文件具有可回顧性，在儀器方法中無需預先設定待測農藥的碎片離子等信息，適合進行農藥多殘留分析。本文對100 μg/L的71種農藥基質標準溶液進行Full MS 掃描，同步采集正構烷烴（C7～C40）的保留時間。利用解卷積技術獲得質譜圖，選擇強度最強的離子作為定量離子，選擇2～5 個碎片離子作為特征碎片離子，確保每個農藥至少有6 個確證點，同時將保留時間和碎片離子信息導出至database 文件，獲得農藥的高分辨質譜信息庫。數據庫還包含同位素信息［29］，如氯元素有35Cl 和37Cl 兩種形式，豐度比約為3∶1，原子量相差1.997 05 Da，其比例關系也可用于定性分析。圖3 為71 種農藥基質標準溶液（100 μg/L）的總離子流（TIC）圖。

圖3 71種農藥混合基質標準溶液（100 μg/L）的總離子流圖Fig.3 TIC chromatogram of 71 pesticides in mixed matrix standard solution （100 μg/L）

2.4 基質效應

實驗發現牛乳提取液不凈化時，有61種農藥的回收率大于120%，存在基質增強效應。基質效應很難徹底消除，現有研究中通過進樣前稀釋、同位素內標校正、內標標準曲線校正、基質匹配標準溶液校正、加入分析保護劑等方法［30-33］減弱基質效應。本研究利用基質匹配標準曲線，并以外環氧七氯作為內標進行測定，可以很好地解決基質干擾。

2.5 線性關系、檢出限與定量下限

定性測定中，目標農藥的保留時間與標準色譜峰保留時間的相對誤差在±2.5%以內，特征碎片離子的質量數與標準色譜峰的相對誤差在±5×10-6以內。在基于精確質量數定量的高分辨質譜分析中，由于提取的色譜圖基線噪音極低，因此采用信噪比方法無法定義檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［28］。本文采用空白基質提取液逐級稀釋標準溶液，直至儀器所能檢出的最低濃度，將該濃度確定為方法的檢出限，以標準曲線最低濃度點作為定量下限。利用空白牛奶提取液對混合標準溶液進行稀釋，配制成質量濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg/L 的系列標準溶液，加入10 μL 外環氧七氯內標溶液，采用本方法進行測定。以各農藥的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，對應峰面積與外環氧七氯峰面積的比值（y）為縱坐標，分別繪制標準曲線。結果表明，甲萘威、滅蠅胺、2 甲4 氯鈉、氧樂果、咪鮮胺的線性范圍為10.0～200.0μg/L，其余66 種農藥的線性范圍均為5.0～200.0 μg/L。71 種農藥的相關系數（r）均不低于0.99，精確質量數偏差均不大于2.55×10-6，檢出限為1.0～2.0 μg/kg，定量下限為5.0～10 μg/kg。

2.6 回收率與相對標準偏差

利用空白牛乳樣品進行加標回收實驗，加標濃度分別為0.01、0.02、0.10 mg/kg，渦旋混勻后靜置1 h，按照“1.3”方法進行加標回收實驗，每個加標水平做6個平行，計算相對標準偏差（RSD），結果見表2。71種農藥的平均回收率為59.6%～117%，RSD為1.9%～13%，除甲萘威（59.6%）的回收率較低外，其余農藥滿足GB/T 27404-2008［34］《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》對回收率的要求。

表2 71種農藥及內標化合物的質譜參數、相關系數（r）、檢出限、定量下限、平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 MS parameters，correlation coefficients（r），LODs，LOQs，average recoveries and RSDs（n=6）of the 71 kinds of pesticides and internal standard compound

2.7 實際樣品檢測

采用本方法分析122份牛乳樣品中71種農藥的殘留情況，牛乳樣品包括27份巴氏殺菌乳、81份超高溫滅菌乳、4 份調制乳、10 份高溫殺菌乳。在2 份超高溫滅菌乳中檢出4，4'-DDE，檢出率為1.6%，檢出值均低于方法定量下限，其他農藥均未檢出。

3 結 論

本文采用QuEChERS 凈化結合GC-Exactive Orbitrap MS 技術，建立了牛乳中71 種農藥的快速篩查和定量檢測方法。該方法操作簡單，準確度和重現性好，已用于大批量實際樣品檢測，為確保乳品質量安全提供了準確可靠的檢測手段。