牛奶中69種獸藥殘留的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜快速篩查

嚴祖浩，李曉薇，夏 曦

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

牛奶已經(jīng)成為我國消費者膳食的重要組成部分，其主要營養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)（3.0%～3.9%）、乳糖（4.4%～5.6%）、脂肪（3.3%～5.4%）和礦物質(zhì)（0.7%～0.8%）［1］。此外，牛奶還是多種微量營養(yǎng)元素的重要來源，包括鈣、磷、鎂、鋅、碘、鉀、維生素 A、維生素D、維生素 B12，這些微量元素對兒童和青少年的生長發(fā)育，以及維持成人身體健康均具有極大幫助［2-3］。由于養(yǎng)殖場對抗菌藥物的不合理和不規(guī)范使用，導(dǎo)致牛奶中抗菌藥物殘留超標并嚴重危害人類公共安全［4］。β-受體激動劑是苯乙醇胺類化合物，在動物飼養(yǎng)中能夠改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進動物肌肉生長及骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，加速脂肪轉(zhuǎn)化和分解，提高牲畜瘦肉率［5］。但畜產(chǎn)品中的激動劑殘留可能會造成人體健康風(fēng)險，哮喘或心血管疾病患者攝入后還可能引起頭暈、心悸、血壓升高、心率加快等心血管系統(tǒng)的中毒反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡［6］。為了確保消費者的食品安全，不同國家對牛奶中抗菌藥物的最大殘留限量（MRLs）做出了規(guī)定，我國在GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定［7］，除磺胺二甲嘧啶（25μg·kg-1）外的磺胺類藥物的MRL 均為100 μg·kg-1；土霉素、金霉素、四環(huán)素的MRL 均為100 μg·kg-1。世界上大多數(shù)國家和地區(qū)，如歐盟、日本等已禁止β-受體激動劑類藥物用于食品動物，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告規(guī)定禁止使用β-受體激動劑類藥物作為獸藥和飼料添加劑［8］。

目前，牛奶中多種獸藥殘留的儀器檢測方法國內(nèi)外均有報道，包括毛細管電泳法［9-10］、高效液相色譜法［11-12］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-14］、超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法［15-16］等。樣品前處理是檢測牛奶中獸藥殘留的關(guān)鍵步驟，一般包括液液萃取［17］、常規(guī)固相萃取［18-19］、分散固相萃取［13，20-21］等。本實驗旨在建立基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）的牛奶中多種獸藥殘留的篩查方法，為牛奶中的獸藥殘留檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；質(zhì)譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），甲醇、正己烷（質(zhì)譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），甲酸（質(zhì)譜純，奇睿化學(xué)科技有限公司），實驗用水由Millipore超純水儀制備。

以下為標準品：

1種喹諾酮類藥物內(nèi)標：恩諾沙星-D5。

30 種β-受體激動劑類藥物：班布特羅、巴美生、溴布特羅、溴代克侖特羅、卡布特羅、西布特羅、克侖塞羅、克侖西羅、鹽酸克侖西羅、異克侖潘特、鹽酸克侖特羅、克侖丙羅、氯丙那林、非諾特羅、福莫特洛、羥甲基克侖特羅、鹽酸苯氧丙酚胺、拉貝洛爾、苯乙醇胺A、利妥特靈、索他洛爾、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、馬噴特羅、馬布臺諾、吡布特羅、可爾特羅、奧西那林、沙美特羅。

15 種β-受體激動劑類藥物內(nèi)標：溴布特羅-D9、卡布特羅-D9、西布特羅-D9、鹽酸克侖特羅-D5、克侖丙羅-D7、氯丙那林-D7、鹽酸氧丙酚胺-13C6、沙美特羅-D（3Salmeterol-D3）、齊帕特羅-D7、苯乙醇胺A-D3、特布他林-D9、妥布特羅-D9、馬布臺諾-D9、吡布特羅-D9、奧西那林-D7。

4種四環(huán)素類藥物：四環(huán)素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素。

β-受體激動劑類藥物及內(nèi)標由德國BVL 實驗室提供，磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類藥物由天津阿爾塔公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class PLUS，沃特世公司），四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（X500 B，美國SCIEX公司），高速冷凍離心機（Eppendorf公司），TARGIN VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司），N-EVAP-112氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.3 溶液配制

標準溶液制備：分別稱取10 mg 標準品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的單標儲備液，置于-20 ℃冰箱中避光保存。

混合標準工作液：根據(jù)實際需要，將單標儲備液混合配制成不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 儀器方法

1.4.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積2μL；流速：0.3 mL/min；流動相A 相為0.1%甲酸溶液，B 相為含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8，體積比，下同）溶液，梯度洗脫程序：0～2 min，95%～85% A；2～5 min，85%～60% A；5～7 min，60%～5% A；7～8.5 min，5% A；8.5～8.6 min，5%～95% A；8.6～10 min，95% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧正離子模式（ESI+）；霧化氣：344 737.85 Pa（50 psi）；加熱氣：344 737.85 Pa（50 psi）；氣簾氣：241 316.50 Pa（35 psi）；加熱氣溫度：500 ℃；碰撞氣：48 263.30 Pa（7 psi）；電噴霧電壓：5 500 V；TOF MS 一級母離子掃描參數(shù)：掃描范圍100～10 000 Da；去簇電壓：80 V；TOF MS/MS 子離子掃描參數(shù)：掃描范圍：50～1 000 Da；去簇電壓：80 V；碰撞能量：35 V；碰撞電壓的變化步階：15 V。

使用SCIEX公司提供的正模式調(diào)諧溶液，對儀器質(zhì)量軸進行校準，參比離子為m/z132.904 90、m/z266.159 81、m/z354.212 24、m/z442.264 67、m/z609.280 66、m/z829.539 33、m/z961.436 96、m/z1 446.732 24 和m/z1 561.603 32，子離子參比離子為m/z58.065 1、m/z86.096 4、m/z235.135 6、m/z174.091 3、m/z365.186 0、m/z448.196 6、m/z724.496 7、m/z607.417 8、m/z512.344 3、m/z811.528 8。

1.5 樣品前處理

稱取1.00 g 牛奶，添加內(nèi)標后靜置10 min，加入0.5%甲酸乙腈5 mL，渦旋振蕩3 min，4 ℃下10 000 r/min 離心5 min。取上清液，加入10 mL 乙腈飽和的正己烷，手搖20 次，4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，棄上清液。下層提取液40 ℃氮氣吹干，加入0.1%甲酸甲醇300 μL，渦旋1 min，加入0.1%甲酸溶液700 μL，渦旋1 min，再加入5 mL 乙腈飽和的正己烷，手搖20 次，4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，棄上清液。下層溶液于4 ℃下14 000 r/min 離心20 min，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗對比了不同色譜柱和流動相對藥物的分離能力，考察了不同色譜柱（COPTECS UPLC Shield RP18（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm））和流動相（0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸-甲醇/乙腈（2∶8））對69種獸藥分離、離子化效率和峰形的影響。結(jié)果表明：Shield RP18 對磺胺對甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪的分離度差，而BEH C18對上述同分異構(gòu)體的分離度良好（圖1）；與0.1%甲酸-乙腈相比，有機相中增加甲醇可以獲得更好的分離效果［22］，且含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8）作為有機相可使目標化合物的峰形更加對稱。所以最終使用BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）色譜柱，0.1%甲酸為水相，含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8）為有機相進行梯度洗脫，以實現(xiàn)目標物化合物的有效分離。69種獸藥的提取離子色譜圖見圖2。

圖1 不同色譜柱的分離效果Fig.1 Separation effect of different columns

圖2 69種獸藥基質(zhì)標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of the matrix standard solution of 69 veterinary drugs

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)采集模式可分為數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA）和數(shù)據(jù)非依賴采集模式（DIA）兩種，其中DDA 是根據(jù)提前設(shè)定的條件，如離子強度、信噪比等對母離子進行篩選，獲得二級質(zhì)譜信息，所得到的二級譜圖無干擾離子，但在非靶向篩查時會出現(xiàn)分析重復(fù)性較差，二級信息覆蓋率低等問題；DIA 則不預(yù)先對母離子進行選擇，在低能量時獲得一級質(zhì)譜圖，高能量時獲得二級碎片，理論上能夠全面地獲得所有離子的碎片信息，但所獲的二級譜圖存在其他母離子碎片的干擾，且數(shù)據(jù)解析時間更長［23］。本實驗對比了DDA和DIA兩種模式在69種獸藥篩查中的差異，發(fā)現(xiàn)二者在目標化合物定量方面的差異不顯著；DDA 模式的二級質(zhì)譜干擾離子較少，可獲得含較高質(zhì)量碎片信息的二級圖譜，以磺胺噻唑為例，其DDA 和DIA 模式下的二級質(zhì)譜圖見圖3。將所有目標化合物通過超高效液相色譜儀進行色譜分離，用Q-TOF MS 進行質(zhì)譜信息采集，并在m/z100～1 000 范圍內(nèi)進行一級質(zhì)譜全掃描，采用DDA模式進行二級質(zhì)譜掃描分析，收集69種目標化合物的保留時間、母離子和子離子精確分子質(zhì)量信息，結(jié)果見表1。

表1 69種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 69 veterinary drugs

圖3 磺胺噻唑的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of sulfathiazole

（續(xù)表1）

2.3 前處理條件的優(yōu)化

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，可能會干擾目標化合物的檢測以及導(dǎo)致色譜柱或儀器管路堵塞等問題，因此需要進行蛋白沉淀。由于對不同種類藥物同時提取存在一定的困難，文獻顯示，對于本文所選的69 種目標物，酸性提取液的效果優(yōu)于中性和堿性提取液［22，24］。本實驗考察了0.1%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈3 種不同提取液對目標化合物的提取效果，結(jié)果表明，隨著甲酸體積分數(shù)的增加，四環(huán)素類和磺胺類藥物的回收率增加，喹諾酮類和β-受體激動劑類藥物的回收率無明顯變化，但1%甲酸乙腈提取部分磺胺類藥物時的回收率偏高，與文獻［25］類似。實驗最終選擇0.5%甲酸乙腈作為提取試劑。

牛奶基質(zhì)復(fù)雜，除富含蛋白質(zhì)外，還有乳脂、乳糖、碳水化合物和少量礦物質(zhì)等雜質(zhì)，因此有必要對樣品進行凈化，減少基質(zhì)的影響。常見的牛奶凈化方法有固相萃取法、低溫冷凍除脂法［24］和正己烷除脂法，其中固相萃取法常使用HLB 和Prime HLB 等萃取柱。本實驗以乙腈飽和的正己烷進行除脂凈化，通過提取后和復(fù)溶后兩次除脂，可有效去除牛奶中大部分的基質(zhì)干擾，減少了過柱等繁瑣操作步驟，更加經(jīng)濟快速，有利于實際樣品的高通量檢測分析。

2.4 基質(zhì)匹配標準曲線及靈敏度

取空白牛奶樣品，按“1.5”進行樣品前處理，量取混合標準工作液適量，用空白樣品提取液溶解稀釋，配制成系列基質(zhì)匹配標準工作溶液，對其中的目標化合物進行測定。對于采用外標法的化合物，以化合物的離子峰面積為縱坐標（Y），標準溶液濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線；對于使用內(nèi)標法的化合物（13 種喹諾酮類藥物、溴布特羅、西布特羅、異克侖潘特、鹽酸克侖特羅、克侖丙羅、氯丙那林、福莫特洛、鹽酸苯氧丙酚胺、苯乙醇胺A、索他洛爾、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、馬布臺諾、吡布特羅、奧西那林、沙美特羅），以化合物的離子峰面積和對應(yīng)內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（Y），標準溶液濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。69種目標化合物在10～200 μg·kg-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.99（表2）。以各目標化合物信噪比為10（S/N=10）時對應(yīng)的濃度作為定量下限（LOQ），69種目標物在牛奶中的LOQ為10 μg·kg-1，具有較好的靈敏度。

表2 69種獸藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量下限及最高殘留限量Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，limits of quantification and maximum residue limits for 69 veterinary drugs

（續(xù)表2）

2.5 回收率與相對標準偏差

對牛奶樣品中的69種獸藥進行10、50、100 μg·kg-13個水平的加標，每個加標水平平行測定6次，計算批內(nèi)平均回收率和批內(nèi)相對標準偏差（RSD）；連續(xù)測定3 天，計算批間平均回收率和批間RSD。外標法定量藥物的批內(nèi)平均回收率為59.0%～120%，批內(nèi)RSD不大于12%，批間平均回收率為62.0%～119%，批間RSD 不大于11%；內(nèi)標法定量藥物的批內(nèi)平均回收率為75.4%～117%，批內(nèi)RSD 不大于12%，批間平均回收率為79.3%～107%，批間RSD 不大于13%，結(jié)果見表3。加標實驗結(jié)果表明該方法具有良好的回收率和精密度，滿足多殘留篩查分析要求。

表3 牛奶中69種獸藥的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 69 veterinary drugs in milk

2.6 實際樣品分析

采用所建立的方法對市場采集的34種不同牛奶樣品進行篩查。首先以一級全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)的母離子精確質(zhì)量數(shù)和保留時間進行比對，通過二級質(zhì)譜碎片離子對檢出的疑似陽性樣品進行確證分析。結(jié)果在1 份樣品中檢出恩諾沙星，含量為18.3 μg·kg-1；另有一份樣品檢出四環(huán)素，含量為32.6 μg·kg-1（圖4）。兩種藥物的檢出含量均未超出其最大殘留限量（100 μg·kg-1）。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜測定牛奶中β-受體激動劑類、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類4 類共69 種限用和禁用獸藥的篩查方法。與傳統(tǒng)獸藥殘留檢測方法相比，本方法優(yōu)化了樣品前處理步驟，可同時快速篩查牛奶中69 種獸藥的殘留量，具有操作簡單、檢測效率高等優(yōu)點。所建立的方法在快速篩查牛奶中獸藥殘留方面有明顯優(yōu)勢，可一次性分析多類不同目標化合物，為牛奶中的獸藥殘留監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支撐。