超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法測定牛奶中51種激素

段鶴君，張 晶，孫佳林，楊潤暉，邵 兵，牛宇敏*

（1.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013；2.首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069；3.中國農業大學 獸醫學院，北京 100193）

作為重要的動物源性食品，牛奶的安全性受到社會廣泛關注［1］。其中激素類藥物在牛奶中的殘留是社會關注的熱點。一方面，激素類藥物可用于治療奶牛的生殖疾病，另一方面，激素能提高飼料轉化率，促進動物生長。因此，激素被奶農非法使用，以促進奶牛性成熟，并增加原奶產量［2］。此外，部分激素被違法添加至牛奶中，使運動員產生興奮從而提高機能狀態［3］。研究表明，過量攝入激素會造成人類生殖系統功能異常，甚至引發前列腺癌和乳腺癌等癌癥［4-6］。世界許多國家和組織對牛奶中激素類藥物制定了最大殘留限量，以保護消費者安全。歐盟理事會指令96/22/EC 和2003/74/EC 禁止某些具有激素作用的物質用于畜牧業［7-8］。中華人民共和國農業部第250 號公告明令禁止己烯雌酚等激素類藥物用于食品動物［9］。世界反興奮劑機構將勃地酮、美睪酮等雄激素和氫化可的松、潑尼松等糖皮質激素列入禁用清單［10］。

激素類藥物包括糖皮質激素、孕激素、雄激素和雌激素等，化合物種類眾多。目前激素類藥物的檢測方法包括放射免疫分析法和酶聯免疫吸附法［11］、氣相色譜法（GC）［12］、液相色譜法（LC）［13］以及液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［14-15］等。相比之下，液相色譜-高分辨質譜聯用技術具有更高的質量精度和更強的檢測通量，在激素類藥物高通量篩查和檢測方面具有顯著優勢［16-17］。在樣品制備方面，《GB/T 21981-2008 動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》［18］規定了動物性食品中50 種激素的檢測需使用ENVI-Carb 和氨基柱兩種固相萃取柱，不適用于激素類藥物的快速篩查。QuEChERS 方法由于操作簡單、檢測成本低且溶劑使用較少，已被用于肉類樣品中激素類藥物的多殘留檢測［19-20］，但在牛奶樣品中的應用研究較少。因此，本研究擬采用QuEChERS 方法實現牛奶基質中激素的多殘留檢測。

本研究選擇常用的四大類獸用激素類藥物（包括雄激素、雌激素、腎上腺皮質激素、孕激素）共51種化合物為研究對象，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（UPLC-Q-TOF MS）獲得化合物的母離子、二級碎片離子精確質量數、保留時間，構建激素類藥物的定性篩查數據庫；通過優化QuEChERS 前處理條件，建立了牛奶中51 種激素的篩查和定量方法，并應用于北京本地市售牛奶樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜-Sciex5600 飛行時間質譜儀，分別購自美國Waters 公司和Sciex 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；Vortex-Genin 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；離心機（美國Beckman Coulter公司）。

51種標準物質（名稱見表1）的純度大于95%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。所有標準物質均在-18 ℃低溫儲存。

表1 51種激素的名稱、分子式、測量質量數、主要碎片、保留時間、檢出限及定量下限Table 1 Chemical names，molecular formulas，measured mass，main fragments，retention times，limits of detection and limits of quantitation of 51 hormones

氧化鋯包覆硅膠（Z-Sep）填料、反相硅膠鍵合相吸附劑（C18）填料購自美國Supelco 公司，N-丙基乙二胺（PSA）、增強型脂質去除凈化管（EMR-Lipid dSPE）購自美國Agilent公司。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取標準品各0.010 0 g，用甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中并用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的標準儲備液。分別準確吸取100 μL 標準儲備液至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準中間液。

基質匹配標準系列溶液：用空白基質提取液將10 mg/L混合標準工作液逐級稀釋，配制成質量濃度為0.1～500 μg/L的基質匹配標準系列溶液，臨用前現配。

1.3 樣品前處理

準確稱取2.0 g（精確至0.01 g）牛奶樣品，加入5 mL乙腈渦旋混勻，超聲提取30 min，于9 500 r/min 4 ℃下離心10 min，轉移上清液至裝有75 mg Z-Sep 填料的離心管中；凈化管渦旋混勻2 min 后，于9 500 r/min 4 ℃下離心10 min，吸取上清液，在微弱的氮氣流下吹干。加入50%甲醇水定容至1 mL，12 000 r/min離心5 min，取上清液待測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序：0～18 min，3%～100% B；18～20 min，100% B；20～21 min，100%～3% B；21～25 min，3% B。

1.4.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI+）；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：241 kPa；輔助氣壓力：379 kPa；霧化氣壓力：379 kPa；去簇電壓：60 V；掃描方式：全掃描一級質譜掃描（TOF MS），質量采集范圍100～1 000 Da；信息依賴觸發的二級質譜掃描（IDA），質量采集范圍50～1 000 Da，碰撞電壓（CE）：35 V，碰撞電壓差（CES）：15 V；分辨率 ＞ 45 000。質譜校正溶液：大氣壓化學電離源（APCI）正離子校正液；校正周期：每5針樣品穿插1針校正溶液以校正質譜質量數。

1.5 定性檢測

1.5.1 高分辨質譜庫建立在LibraryView 中輸入51 種激素的分類、中英文名稱及化學式，得到每個化合物的理論質量數。進樣50 μg/L 的混合標準工作溶液，在TOF MS 模式下得到每種激素的保留時間和母離子精確質量數測定值；在IDA 模式下，得到每種激素的碎片離子譜圖，將二級譜圖導入高分辨質譜譜庫，與相應的保留時間、精確質量數測定值、中英文名稱等信息關聯，完成譜庫構建。

1.5.2 定性篩查分析通過PeakView 軟件對目標化合物的保留時間、母離子及碎片離子的精確質量數與譜庫的匹配情況以及同位素分布等參數進行定性篩查分析。如檢出的色譜峰保留時間與譜庫中的保留時間偏差小于2.5%、母離子精確質量數與理論質量數的偏差小于5 ppm，且同位素偏差在10 ppm以內，則初步判定試樣中含有該激素。進一步在IDA 模式下比對其二級碎片離子，如果有2 個及以上豐度較高的碎片離子與譜庫中相應的碎片離子質量數偏差在10 ppm 以內，且相對豐度與濃度接近的標準工作液中對應碎片離子的相對豐度一致，可判定試樣中含有該激素。

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

配制質量濃度為50 μg/L的51種激素混合標準溶液，采用UPLC-Q-TOF MS 在全掃描模式下獲得各激素的一級質譜圖，并優化出最佳的碎裂電壓、干燥氣溫度及流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度和流速、毛細管電壓。在ESI+條件下，所有化合物均有響應。進一步比較了不同流動相（甲醇、乙腈）以及添加劑（0.1%甲酸）的影響。如圖1 所示，當流動相為甲醇-0.1%甲酸水時，會促進目標物的電離，顯著提高目標化合物的響應，所以最終選擇甲醇和0.1%甲酸水作為流動相。

圖1 不同流動相條件下51種激素的一級全掃描總離子流圖（50 μg/L）Fig.1 Total ion chromatograms of 51 hormones（50 μg/L） under different mobile phase conditions

2.2 前處理條件的優化

牛奶樣品含有豐富的脂肪和蛋白質，乙腈通常被用作提取溶劑，以去除牛奶中大部分蛋白質。本研究采用乙腈作為提取溶劑，51 種目標化合物的回收率為61.3%～119%。然而乙腈提取液中含有大量的脂肪等干擾物，一方面影響分析結果的準確性，同時還會縮短色譜柱的使用壽命。為進一步去除脂肪，以加標回收率和基質效應為評價指標，對比了5種除脂方法：冷凍除脂、EMR 填料除脂、C18填料除脂、PSA填料除脂、Z-Sep填料除脂。基質效應為目標物在空白基質中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比。當基質效應為70%～130%時，表示無基質效應；高于130%時，表明存在基質增強效應；低于70%時，表示存在基質抑制效應［21-22］。

不同填料凈化后目標化合物在不同回收率范圍的化合物個數如圖2A所示，經PSA填料除脂后僅有4 種化合物的回收率為80%～120%，經EMR 填料凈化除脂后有9 種化合物的回收率為80%～120%。冷凍除脂、C18填料和Z-Sep 填料3 種除脂方法，回收率在80%～120%范圍的激素分別為44、46 和47 種。不同填料凈化后目標化合物在不同基質效應范圍內的化合物個數如圖2B 所示，冷凍除脂后有41 種化合物無基質效應，C18填料凈化后有47 種化合物無基質效應，Z-Sep 填料凈化后有48 種化合物無基質效應。進一步比較了牛奶加標樣品經Z-Sep 填料和C18填料凈化后UPLC-Q-TOF MS 識別的絕對峰個數，如圖2C 所示，經Z-Sep 填料凈化后UPLC-Q-TOF MS 獲得的識別峰個數為2 285 個，比經C18填料凈化后獲得的識別峰個數（3 715個）減少約38%。因此本研究選擇Z-Sep填料進行凈化。

圖2 不同除脂方式凈化后目標化合物在不同回收率范圍（A）與不同基質效應范圍（B）的個數，牛奶加標樣品經C18填料和Z-Sep填料凈化后獲得的識別峰個數（C）Fig.2 The number of target compounds purified by different degreasing methods in different recovery ranges（A） and different matrix effect ranges（B），and the number of recognition peaks obtained from the spiked milk purified with C18 and Z-Sep sorbents（C）

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限在優化的實驗條件下，樣品按“1.3”方法進行前處理后加入混合標準工作液，經UPLC-Q-TOF MS 測定，繪制工作曲線，外標法定量。以信噪比（S/N）≥ 3 對應的添加水平作為方法檢出限（LOD），S/N≥ 10對應的添加水平作為定量下限（LOQ）。結果表明，51種激素在0.10～500 μg/L 范圍內呈線性關系，相關系數（r2）均大于0.99。目標物的名稱、分子式、測量質量數、主要碎片、保留時間、LOD 和LOQ 如表1 所示。51 種激素的LOD 為0.03～1.67 μg/kg，LOQ 為0.10～5.00 μg/kg。

2.3.2 回收率與相對標準偏差選用空白牛奶樣品，分別添加5、10、50 μg/kg 的目標物，每個加標水平做6 個平行，結果見表2。除十一酸睪酮、苯丙酸諾龍、康復龍、皮質甾酮的回收率為44.6%～59.6%外，其余47種目標化合物的回收率為61.3%～120%，相對標準偏差（RSD）均在20%以內。本方法的準確度和精密度滿足測定要求。

表2 51種激素的回收率及相對標準偏差（n = 6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 51 hormones（n=6）

2.4 實際樣品分析

應用本方法檢測北京本地超市售賣的20 份牛奶樣品，其中19 份樣品檢出孕酮，檢出量為0.80～4.51 μg/kg，1 份樣品檢出痕量的氫化可的松，檢出量為0.62 μg/kg，其他激素化合物均未檢出。圖3為1 份陽性樣品的提取離子流圖、一級質譜同位素豐度比圖譜與二級質譜鏡像圖。《GB 31650-2019 食品中獸藥最大殘留限量》［23］規定氫化可的松僅作外用，未指定殘留限量。段永生等［24］對市售10 種牛奶及進口乳清粉進行測定，發現所有樣品均含有孕酮，含量為1.7～2.6 μg/kg。吳肖肖等［25］在10份牛奶樣品檢測到1份樣品含有氫化可的松，含量為0.35 μg/kg。本文實際樣品中的激素種類和含量范圍與上述文獻的測定結果基本一致。

圖3 陽性樣品的提取離子流圖（A、B）、一級質譜同位素豐度比圖譜（C、D）與二級質譜鏡像圖（E、F）Fig.3 Extracted ion chromatograms（A，B），isotope ratio mass spectra（C，D） and secondary mass spectra mirror images（E，F） of positive samples

3 結 論

本文利用QuEChERS 結合UPLC-Q-TOF MS 分析技術，建立了牛奶中51 種激素的同時定量檢測方法。本方法利用Z-Sep 填料進行樣品凈化，有效降低了測定過程中脂肪的干擾，具有較好的回收率和靈敏度，滿足激素檢測的技術要求，可應用于大批量樣品的快速、準確測定。