超高效液相色譜-串聯質譜篩查確證尿液中磺胺、喹諾酮與四環素抗生素

張 楠，唐增煦，王莉莉，孫開奇，趙 榕*，范 賽*

（1.北京市疾病預防控制中心，北京市預防醫學研究中心，北京 100013；2.中國疾病預防控制中心營養與健康所，北京 100050）

四環素類、磺胺類和喹諾酮類廣譜抗生素是常見的既可治療人類疾病，又可作為生長促進劑促進動物生長的化學物質［1］，因此在醫藥衛生及動物養殖行業得到了廣泛使用。然而，過度使用抗生素不僅會誘使病原體產生抗藥性，還會對人體多方面產生有害影響［2-3］。我國是世界主要的抗生素生產和使用國家之一，已在境內不同的環境基質中檢出多種抗生素殘留［4］，這些抗生素導致的環境污染、細菌耐藥以及生態毒理效應等環境問題，已成為目前我國亟需解決的環境問題之一［5］。四環素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的半衰期雖然較短，但由于其應用廣泛并已進入各類環境基質和動物性食品中，導致了環境中抗生素的“假持續”現象［6］，成為威脅公眾安全及生態系統的一大隱患。近年來，對抗生素的研究多集中于其在環境與動物性食品中的殘留以及使用現狀［7-9］，對人體的抗生素暴露劑量及抗生素對人群健康影響的研究則十分匱乏，這可能是由于人體生物基質中抗生素的檢測方法開發存在困難。因此，為監測人體內抗生素的暴露水平以及評估其對人群可能產生的健康影響，亟需建立人體生物樣本中抗生素的檢測技術。

進入人體體內的抗生素僅有部分會被消化吸收，約30%～90%的抗生素在進入人體后8～24 h內通過尿液和糞便排出［10］，同時，尿液的采集具有無創性和易得性，因此尿液是代替血液對體內抗生素水平進行監測的良好生物基質。前期研究顯示，學齡兒童抗生素水平的高暴露與兒童肥胖直接相關［11-12］，為了開展學齡兒童的抗生素暴露譜研究，開發尿液中抗生素的檢測方法非常必要。然而，現有研究大多數僅針對單個抗生素，或單一類別的抗生素，很少涉及多類別抗生素［13-15］研究。因此，本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）對人尿液中的16種磺胺類、20種喹諾酮類和9種四環素類共45種抗生素進行了同時檢測，并應用建立的方法對北京市280例6～17歲學齡兒童尿液樣本中的抗生素進行了篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ThermoScientificTMSQAltisTM三重四極桿質譜儀（美國Themo Scientific 公司）；Milli-Q 超純水制備系統（美國Millipore 公司）；Anavo HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL，北京納鷗科技有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級，北京納鷗科技有限公司），EDTA-2Na（優級純，北京分析試劑廠）。除特殊說明外，所有實驗試劑均為分析純。

標準品：16 種磺胺類藥物（磺胺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲唑、磺胺異唑、磺胺苯吡唑）混合標準溶液的質量濃度為10 μg/mL，20 種喹諾酮類藥物（脫乙烯基環丙沙星、馬波沙星、依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、司帕沙星、二氟沙星、西諾沙星、哌啶酸、喹酸、萘啶酸、氟甲喹）混合標準溶液的質量濃度為10 μg/mL，9種四環素類藥物（二甲胺四環素、4-差相土霉素、土霉素、甲基土霉素、四環素、去甲基金霉素、金霉素、多西環素、4-差相四環素）混合標準溶液的質量濃度為100 μg/mL。混標均購自北京Dikma公司。

1.2 標準溶液的配制

分別精確吸取16種磺胺類藥物混標溶液1.00 mL、20種喹諾酮類藥物混標溶液1.00 mL、9種四環素類藥物混標溶液0.10 mL于同一個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制備成3類抗生素的混合標準儲備液（質量濃度均為1.0 μg/mL），儲存于-20 ℃冰箱內備用。精確吸取3 類抗生素的混合標準儲備液1.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制備成3類抗生素的混合中間液（質量濃度均為100.0 ng/mL）。

1.3 樣品前處理

取尿液樣品5.0 mL 置于15 mL 離心管中，加入 0.1 mol/L 的EDTA-2Na 緩沖溶液5.0 mL，渦旋混勻30 s 后過HLB 固相萃取柱。HLB 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇和6 mL 水活化，然后將尿液混合液全部上樣至該萃取柱，隨后用6 mL 水對萃取柱進行淋洗以除去雜質，真空泵下抽干萃取柱中的殘留水分。隨后使用6 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液以氮氣流吹干。用0.5 mL 甲醇-水（1∶1，體積比）復溶，裝入1.5 mL塑料離心管，10 000 r/min離心10 min，上清液供儀器測定。

1.4 UPLC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：ThermoAccucore RP-MS 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.35 μL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為乙腈，B為0.02%甲酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序：0～15 min，5%～95% A；15～17 min，95% A；17～17.1 min，95%～100% A，17.1～19 min，100% A；19～19.1 min，100%～5% A；19.1～22 min，5% A。

1.4.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓：3.5 kV；離子傳輸管溫度：350 ℃；輔助氣加熱溫度：325 ℃；鞘氣：5.58 L/min（50 Arb）；輔助氣：7.97 L/min（10 Arb）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應監測（SRM）模式；各待測物的質譜信息及保留時間等參數詳見表1。

表1 各化合物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of each compound

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化為確定質譜參數，通常采用流動注射的方式進行參數確認，在正離子（ESI+）掃描模式下，磺胺、喹諾酮、四環素類抗生素化合物及其代謝產物多為正離子，在液相色譜-質譜檢測中一般會產生［M+H］+的分子離子峰。質譜檢測過程中，高分辨質譜多用來定性篩查，再通過三重四極桿質譜進行定量檢測。本研究嘗試采用三重四極桿質譜完成定性篩查，并進行定量檢測。定性檢測中，離子對的選取多參考歐盟2002/657/EC規范，當兩個離子對滿足IP 4分法時，即可進行質譜定性。但實際檢測中發現，定性離子受到干擾時，不能滿足定性要求，將造成假陰性誤判。在三重四極桿質譜儀缺少飛行時間質譜儀定性的情況下，采用多離子對結合豐度比的定性方式，可以滿足定性的要求，避免基質干擾帶來的誤判。本研究絕大部分化合物采用3 對或以上的定性定量離子對，避免了檢測結果的不確定性，可以獲得更準確的定性結果，同時以三重四極桿質譜進行定量分析，可同時實現篩查確證與定量，詳細質譜信息見表1，各化合物的基質混合標準溶液譜圖見圖1～3。

圖1 16種磺胺類抗生素的基質混合標準溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.1 Chromatograms of 16 sulfonamide antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

圖2 20種喹諾酮類抗生素的基質混合標準溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.2 Chromatograms of 20 quinolone antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

圖3 9種四環素類抗生素的基質混合標準溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.3 Chromatograms of 9 tetracycline antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

2.1.2 液相色譜條件的優化正離子模式下，一般在流動相中添加甲酸可提高響應值，增加靈敏度，但使用Thermo Accucore RP-MS 色譜柱檢測時，部分抗生素在甲酸體系下的峰形會出現展寬，導致靈敏度下降。因此，本研究分別考察了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.05%甲酸水溶液-乙腈、0.02%甲酸水溶液-乙腈、純水-乙腈為流動相時對目標化合物色譜行為與質譜響應的影響。結果顯示，以Thermo Accucore RP-MS 色譜柱為分離柱時，選用0.02%甲酸水溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫，45 種化合物峰形良好，靈敏度最高。

2.2 前處理條件的優化

磺胺、喹諾酮、四環素類抗生素是目前最為常見的幾類獸藥，國家針對這3 類抗生素制定了一系列動物性食品檢測方法，GB 31658.17-2021《食品安全國家標準 動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定》［17］中同時規定了基于HLB 固相凈化小柱的此3 類抗生素的混合前處理方法。同時，基于該固相小柱檢測多種抗生素殘留的方法已經有大量報道［16］，國標方法與文獻方法中均對HLB小柱的優化條件進行了介紹，此處不再贅述。

抗生素在動物性食品中的低殘留導致人體尿液樣本中的殘留量極低，不宜采用QuEChERS 方法進行凈化。而固相萃取柱具有較強的濃縮富集性，可將大體積尿液樣本通過過柱的方法進行濃縮。本文通過固相萃取柱將5 mL 尿液中的3 類抗生素吸附到柱上并將體積濃縮至0.5 mL，提高了檢測靈敏度。另外，由于四環素類藥物極易與金屬螯合導致回收率下降，故加入0.1 mol/L EDTA-2Na溶液以避免四環素類藥物的螯合，提高其回收率；同時，磺胺類化合物在酸性條件下易發生降解，應避免在前處理過程中引入甲酸等酸性溶劑，防止磺胺類化合物回收率下降。

2.3 檢出限及定量下限

為減少基質抑制效應對3 類抗生素檢測結果的影響，采用陰性尿液制備空白基質溶液，并配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的基質匹配標準溶液，以色譜峰面積對相應標準溶液中化合物的質量濃度進行線性回歸。結果顯示，在0.5～20.0 μg/L 范圍內，各物質線性良好，線性相關系數（r）均大于0.999。以信噪比為3時對應的質量濃度為方法檢出限（LOD），信噪比為10時對應的質量濃度為定量下限（LOQ），磺胺、喹諾酮、四環素3類目標物的LOD為0.1～0.5 μg/L，LOQ為0.3～1 μg/L，結果見表2。

表2 方法的檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差（RSD， n=6）Table 2 LODs，LOQs，recoveries and RSDs of the method（n=6）

（續表2）

2.4 回收率及相對標準偏差

以陰性尿液樣品為基質，進行2.0、5.0、10.0 μg/L 3個水平的加標實驗，計算回收率和相對標準偏差（RSD，n=6），結果見表2。由表可見，本方法的回收率為78.6%～114%，RSD為0.60%～18%。方法準確度及精密度良好，可用于尿液中磺胺、喹諾酮、四環素3類抗生素殘留的篩查與定量檢測。

2.5 實際樣品測定

對采集的280 份北京市健康兒童、青少年的尿液樣本進行檢測，均未檢出相關抗生素殘留。檢測對象為健康人群的尿液樣本，故抗生素暴露來源于膳食攝入，該檢測結果與北京市近年來食品安全風險監測的獸藥殘留監測數據相一致。在實際樣本檢測過程中，以每70 份樣本加做6 個平行回收進行質量控制，在5.0 μg/L的加標水平下，方法回收率在80%～100%之間，RSD值小于10%。

3 結 論

本文基于超高效液相色譜-串聯質譜法成功測定了尿液中的3 類共45 種抗生素，建立的方法簡單準確，為人體生物基質中抗生素的檢測提供了新思路。