茶葉中21種吡咯里西啶生物堿檢測方法研究

萬靜宜，馮 超，陳宇航，徐 騫，林元杰，樂孫陽，盧大勝，邱歆磊

（上海市疾病預防控制中心，上海 200336）

吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物所產生的次生代謝產物，含有該物質的植物廣泛分布在世界各地，目前已在6 000多種植物中檢出近600多種不同的PAs及其氮氧化物（PANOs）［1］。攝入高劑量PAs可能導致肝臟損傷，動物實驗發現其具有遺傳毒性和致癌性，吡咯啶環的1，2位為雙鍵的PAs 被稱為肝毒性吡咯里西啶生物堿（HPAs），在臨床上可導致肝竇阻塞綜合征（HSOS）［2-5］。茶葉是全球消費最廣泛的飲料之一，其本身不含有PAs，但因茶園中存在含有PAs的植物，可能通過土壤、水等環境循環造成茶樹根部吸收從而污染茶葉，同時部分茶園在采摘過程中使用機器收割代替人工采摘可能混入含PAs的雜草從而造成污染［6-8］。

2020年，歐盟發布相關條例規定PAs在茶葉和調味茶中的限量為150 μg/kg，該限量為21種PAs的總和［9-10］。隨著歐盟法規頒布，茶葉中PAs的檢測越來越受到關注。目前PAs的主要檢測方法包括液相色譜法［11］、免疫吸附法［12］、液相色譜-質譜聯用法［13-15］等，其中液相色譜法的檢測靈敏度較低，無法對微量或痕量的目標物進行準確檢測，適用于中草藥這類PAs 含量較高的樣品；免疫吸附法雖能夠快速檢測，但無法準確定量；而高效液相色譜-質譜聯用法具有靈敏度高［16］、適用范圍廣、選擇性強、操作方便等優點，是國際上普遍采用的分析方法［17-19］。目前，我國有關茶葉中PAs檢測研究的報道較少，且文獻報道的檢測目標物未能涵蓋歐盟法規要求的21種化合物［14］。我國作為茶葉生產與出口大國，亟需建立一種目標物能夠涵蓋歐盟限量標準的準確、高效、批量篩查茶葉中PAs的檢測方法。

本文采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法對促黑激素、石松胺、促黑激素N-氧化物、石松胺N-氧化物和千里光堿等歐盟限量標準中21種PAs進行檢測，可為茶葉等植物源性產品中PAs的來源、組成及風險評估提供技術依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Infinity 1290 高效液相色譜-串聯Agilent 6490 三重四極桿質譜儀（美國Agilent 公司）、Milli-Q 型超純水系統、EZ-2 溶劑蒸發工作站（英國GeneVac 公司）、Vortex 3 渦旋混合儀（德國IKA 公司）、分析天平（Mettler Toledo公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

甲醇（色譜純，Fisher公司）；硫酸（優級純，上海柯靈斯公司）；甲酸（質譜級，Fisher公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為GB/T 6682-2008［20］規定的一級水。21 種待測物標準品均購于上海源葉公司。

PTFE 微孔濾膜（13 mm×0.22 μm）、Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱（200 mg/6 mL，安捷倫公司）、Waters Oasis MCX 固相萃取小柱（150 mg/6 mL，沃特世公司）、Waters Oasis HLB 固相萃取小柱（150 mg/6 mL，沃特世公司）。

1.2 標準溶液配制

標準儲備溶液（1 000 mg/L）：準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）各PAs 標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備溶液，置于-18 ℃下低溫避光保存，使用時根據需要混合稀釋。

1.3 樣品前處理

提?。悍Q取 2.0 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.05 mol/L 硫酸，渦旋振蕩10 min 后靜置過夜，4 ℃下以10 000 r/min 離心5 min，移取10 mL 上清液至15 mL 聚丙烯離心管中。

凈化：使用5 mL甲醇和5 mL 0.05 mol/L 硫酸活化PCX 固相萃取小柱，取10 mL樣品上清液通過活化后的PCX 固相萃取小柱，并用5 mL 甲醇和5 mL 水淋洗，再用10 mL 5%氨水甲醇洗脫。收集全部洗脫液濃縮至近干，10%甲醇水定容至0.50 mL，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm濾膜后進樣分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex Kinetex F5（150 mm×3.0 mm×2.6 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A 為甲醇，B 為0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，10%～15%A；1～6 min，15%～20% A；6～18 min，20%～50% A；18～24 min，50%～70% A；24～26 min，70%～80% A；26～26.2 min，80%～10% A；26.2～27 min，10% A。

1.4.2 質譜條件離子源：ESI（+）；毛細管電壓：3 000 V；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L/min；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；霧化氣壓力：138 kPa（20 psi）；檢測方式：多反應監測（MRM）。各化合物的保留時間、母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 21種吡咯里西啶生物堿的質譜參數與保留時間Table 1 MRM parameters and retention times of 21 pyrrolizidine alkaloids

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

由于促黑激素與石松胺的質譜碎片一致，兩者無法在質譜MRM模式下進行分離，需通過色譜分離后進行定量檢測。國內外研究主要使用C18色譜柱對PAs 進行分離［13-14，17］。五氟苯基色譜柱（F5）為基于核-殼技術的五氟苯基丙基固定相色譜柱，對同分異構體的選擇性較好，因此對比了Waters ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）與Phenomenex Kinetex F5 色譜柱（150 mm×3.0 mm×2.6 μm）對21種PAs的分離效果。結果表明，使用Waters ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）無法有效分離促黑激素與石松胺。Kinetex F5 色譜柱對促黑激素與石松胺同分異構體的分離效果更好，且其余19 種化合物均能實現基線分離。因此，本研究選擇Phenomenex Kinetex F5 色譜柱，21 種PAs 的色譜圖見圖1。

2.2 前處理方法優化

2.2.1 提取溶劑PAs是一類還原性生物堿，其氧化形式（PANOs）也屬于極性分子，易被極性有機溶劑或稀釋后的酸化水溶液提?。?5-16，21］?？紤]到日常生活中人們的泡茶習慣，本實驗選取1款實際綠茶樣品，比較了0.05 mol/L 硫酸、60 ℃水、80 ℃水及沸水4 種提取溶劑對檢測結果的影響。結果顯示，上述溶劑檢出的PAs 總量分別為85.4、55.6、64.1、60.3 μg/kg，0.05 mol/L硫酸的提取效率最高，這可能是由于硫酸水溶液提高了樣品中PAs 的離子化效率。因此，本研究選用0.05 mol/L 硫酸作為提取溶劑。

2.2.2 凈化方式國內外研究主要使用MCX 固相萃取小柱、PCX 固相萃取小柱和HLB 固相萃取小柱對樣品進行凈化處理［14-15，21］。本實驗比較了Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱（200 mg/6 mL）、Waters Oasis MCX 固相萃取小柱（150 mg/6 mL）和Waters Oasis HLB 固相萃取小柱（150 mg/6 mL）對綠茶加標樣品的凈化效果（見圖2）。結果顯示，21 種PAs 采用上述萃取柱凈化的回收率分別為65.2%～107%、62.4%～105%和46.6%～105%，PCX柱與MCX柱的總體回收率接近，但千里光非林、千里光非林 N-氧化物、千里光堿與春千里光堿采用PCX 柱凈化的回收率比MCX 柱高10%以上，故選擇Bond Elut Plexa PCX柱作為前處理的凈化柱。

圖2 不同SPE凈化柱的回收率比較Fig.2 Comparison of recoveries of different SPE purification cartridges

2.2.3 SPE 洗脫條件經前期實驗，本研究選擇5%氨水甲醇作為洗脫溶劑，為了更好地平衡洗脫效率和洗脫體積，對洗脫體積（6～11 mL）進行了優化。結果顯示，隨著洗脫體積的增加，21 種PAs 的回收率總體呈增加趨勢；10 mL 5%氨水甲醇的洗脫效果達到最佳，21 種PAs 的回收率為74.3%～98.6%，洗脫體積為11 mL與10 mL時目標物的回收率無較大差異。因此選擇洗脫體積為10 mL。

2.3 方法評價

2.3.1 基質效應、線性關系與檢出限本研究通過比較溶劑標準曲線與基質匹配標準曲線的斜率評估基質效應（ME）［22］。計算公式：ME =B/A× 100%（其中A為溶劑標準曲線斜率，B為基質匹配標準曲線斜率）。表2結果顯示，21種PAs的基質效應為14.3%～153%，表明大部分化合物存在基質抑制效應，因此采用基質匹配標準曲線對目標物進行定量分析。

表2 目標物的線性關系、基質效應及檢出限Table 2 Linear relations，matrix effects and LODs of the analytes

以空白茶葉為基質，經過樣品前處理后得到基質空白溶液，配制標準曲線溶液，并采用本方法進行測定。結果表明，21種PAs在對應質量濃度范圍內均顯示良好線性關系（r2≥0.995 0），方法的檢出限（LOD）為0.3～1.0 μg/kg（見表2）。

2.3.2 準確度與精密度以空白茶葉為基質配制低、中、高3個加標濃度樣品，進行準確度與精密度驗證，每個濃度重復6次（見表3）。結果顯示，3個加標水平下目標物的回收率為72.1%～108%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～9.8%。表明本方法的準確度和精密度較好，能滿足目標物的分析要求。

表3 目標物的平均回收率與相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of the analytes（n=6）

2.4 實際樣品測定

采用本方法對市售的60件茶葉樣品進行檢測，包括紅茶、茉莉花茶、鐵觀音、大紅袍、毛尖綠茶等，其中5 件樣品檢出PAs，總含量為1.8～85 μg/kg，結果均小于歐盟限量標準（150 μg/kg），具體見表4。

表4 樣品中21種PAs的檢出含量（μg/kg）Table 4 Detected contents of 21 PAs in the samples（μg/kg）

3 結 論

本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）同時檢測茶葉中21種PAs的方法。該方法的準確度和精密度良好，通過對市售實際樣品進行檢測，證實了該方法的適用性。此方法涵蓋了21 種PAs，與文獻方法［14］相比，能夠更加準確地確定樣品中PAs 的總含量，檢測靈敏度達到國際同等水平，為茶葉等植物源性產品中PAs的來源、組成及風險評估提供了技術依據。