泰樂菌素發酵補料工藝優化研究

陳東，郭佳，王婷，白海龍，哈麗媛

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

泰樂菌素(Tylosin)，又稱泰樂星、泰樂霉素，一種禽畜專用的由弗氏鏈霉菌產生的十六元大環內酯類抗生素[1-2]。泰樂菌素不僅是我國畜禽養殖業防治支原體疾病的理想藥劑，而且是一種優良的飼料添加劑，除疾病預防外，對禽、畜生長也有良好的促進作用。

在菌種發酵過程中，補料量、pH值、溶解氧濃度、溫度、底物濃度、產物濃度等對微生物的生長起重要作用[3-4]。泰樂菌素在發酵后期由于菌體易老化和自溶，導致生產能力下降，嚴重影響泰樂菌素產量[5]。當前，國內泰樂菌素生產工藝普遍采用分批補料的方式，通過控制和優化補料量等參數的變化，使發酵效價達到最大[6]。然而，現有工業生產中對泰樂菌素發酵補料時間及補料次數的研究鮮有報道。因此，本研究以泰樂菌素分批補料發酵工藝為基礎，對泰樂菌素發酵補料工藝進行優化研究，探討泰樂菌素發酵的最佳補料時間和補料次數。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

豆油、硫酸銨；綜合補料培養基成分組成：玉米淀粉為0.5%、(NH4)2HPO4為 0.2%、麩質粉為1.0%、CaCO3為0.8%、棉籽餅粉為1.5%、硫酸鎳為0.2%、NaCl為0.5%、KCl為0.1%、CoCl2為 0.8%、純化水(其余)。

1.2 儀器

實驗儀器如表1所示。

表1 實驗儀器

2 材料與方法

2.1 實驗材料

泰樂菌素菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

2.2 實驗方法

泰樂菌素效價采用高效液相色譜法(HPLC)檢測：發酵液殘糖采用菲林試劑法檢測；采用甲醛氧化法檢測發酵液中氨基氮含量。

2.3 數據處理

所得試驗數據均采用Microsoft Excel 2010進行數據處理分析。

3 結果與分析

3.1 補油對泰樂菌素效價的影響

豆油含有豐富的油酸和亞油酸，二者經過甲基化生成甲基油酸，其作為泰樂菌素的前體物質，能促進泰樂菌素的生物合成，因此工業生產中常以豆油作為泰樂菌素發酵的主要碳源[7]。相關研究證明，豆油濃度影響泰樂菌素的產量，其含量過低，不利于泰樂菌素菌絲生長，而含量過高不易充分利用，造成脂肪酸過量，降低發酵液pH值，影響菌種產素能力，降低泰樂菌素產量[8]。因此，泰樂菌素菌種發酵過程中，嚴格控制豆油的加量對其發酵起至關重要的作用。

接種8 h后，每隔4 h檢測發酵液pH值，當pH值小于6.6時，以0.2%進料量補加豆油，維持泰樂菌素發酵液pH值處于7.0～7.2之間。接種48 h后，每隔24 h進行泰樂菌素發酵液效價測定，觀察補加豆油后泰樂菌素發酵液效價變化趨勢。圖1結果表明：補加豆油后泰樂菌素發酵液效價增速顯著提高，在發酵后期高達14 100 μg/mL，較無補油增高了19.90%。原因可能是及時補加豆油不僅為泰樂菌素發酵提供碳源，而且其脂肪酸分解后通過調節發酵液的pH值，使之處于菌體產素的最佳范圍，從而提升了泰樂菌素發酵效價。

圖1 補油對泰樂菌素效價的影響

3.2 補加硫酸銨對泰樂菌素效價的影響

接種8 h后，每4 h檢測1次氨基氮含量，根據氨基氮含量補加硫酸銨，流速為0.15%/d，接種48 h后，每隔24 h進行泰樂菌素發酵液效價測定，觀察補加硫酸銨后泰樂菌素發酵液效價變化情況。泰樂菌素氨基氮檢測結果如圖2所示，泰樂菌素發酵效價變化情況如圖3所示。

圖2 泰樂菌素氨基氮檢測結果

圖3 補加硫酸銨對泰樂菌素效價的影響

根據發酵液中的氨基氮含量優化補料工藝，以期提升泰樂菌素發酵效價。補加硫酸銨使氨基氮水平維持在50～90 mg/mL之間。由圖3可知，隨著發酵周期的延長，補加硫酸銨后泰樂菌素發酵效價增速明顯提升，且在發酵后期高達13 900 μg/mL，較無補料效價提高了25.68%。

3.3 單次補料時間對泰樂菌素發酵效價的影響

基于豆油和硫酸銨的補料發酵情況及發酵液中的殘糖含量進行單次補料實驗，分別于發酵48、72、96、120、144 h后進行單次補料，研究單次補料時間對泰樂菌素發酵效價的影響。泰樂菌素殘糖濃度檢測結果如圖4所示，泰樂菌素效價變化情況如圖5所示。

圖4 泰樂菌素殘糖濃度檢測結果

圖5 單次補料對泰樂菌素發酵效價的影響

由圖4可知，補料使泰樂菌素殘糖濃度維持在0.50～2.00 g/100 mL之間。由圖5可知：單次補料發酵效價顯著高于無補料發酵效價，其中在48 h補料時效果最佳，發酵液效價增速穩定，發酵后期效價高達13 987 μg/mL，顯著高于其他補料批次；96 h補料次之，其發酵效價增速相對穩定，但效價低于48 h補料發酵效價；72 h補料對泰樂菌素發酵效價增速促進不大，在發酵后期，增速減弱；120 h和144 h補料對泰樂菌素發酵效價促進作用較小，最終發酵效價顯著低于其他實驗批次。

3.4 兩次補料對泰樂菌素發酵效價的影響

在單次補料實驗基礎上，嘗試在發酵48 h補料后分別在72 h、96 h、120 h、144 h 進行第2次補料，每隔24 h測定發酵液效價，研究兩次補料對泰樂菌素發酵效價的影響，如圖6所示。

圖6 2次補料對泰樂菌素發酵效價的影響

由圖6可知，兩次補料顯著提升了泰樂菌素發酵效價，尤其在發酵96 h進行第2次補料時，其發酵效價顯著高于其他實驗批次，達到14 500 μg/mL，效價增速穩定；其次是發酵72 h進行第2次補料，最終效價為13 100 μg/mL，較96 h補料發酵效價降低了10.69%；120 h進行第2次補料后泰樂菌素發酵效價增速緩慢；144 h 進行第2次補料最終發酵效價顯著低于其他實驗批次發酵效價。

4 討論

無補料發酵工藝因發酵前期發酵液營養豐富，菌體快速生長，后期缺乏菌體必需營養素而造成早衰，影響菌體產素能力。相關研究證明，菌種發酵過程中，優化補料量不僅能降低能源消耗與經濟成本，更能提高菌種發酵效率[9-10]。因此，基于豆油和硫酸銨的補料發酵情況及發酵液中的殘糖含量和氨基氮含量優化泰樂菌素補料工藝，通過對補料次數和補料時間進行研究發現，兩次補料發酵效價提升效率更高，其最終效價較單次補料發酵效價提高了3.67%，且最優補料時間分別是在發酵48 h和96 h，發酵效價從13 987 μg/mL提高至14 500 μg/mL。原因可能是發酵初期，泰樂菌素新生菌絲較多，但在中后期，尤其是在后期菌體出現自溶，菌絲減少進而影響菌體產素能力，而后期補料能及時提供菌體所需營養，延緩菌體早衰、促進新生菌絲的形成，從而提升泰樂菌素的發酵效價。基于本研究，推測多次補料可為泰樂菌素菌種提供更均衡的營養物質，提高菌種產素能力，對發酵效能及產量提升效率更高，擬在下一步實驗中進行泰樂菌素多次補料研究，以期獲得更高的發酵效價，提高泰樂菌素產量。