一種含嗎啉修飾的多吡啶鈀(Ⅱ)配合物的合成、表征與抗金黃色葡萄球菌作用研究

王潤賓,韓天植,李知敏,堯智玲,廖向文,王金濤

(江西科技師范大學藥學院,南昌 330013)

0 引 言

金黃色葡萄球菌是一種常見的可引起感染的細菌[1],應對金黃色葡萄球菌感染的問題一直是全球致力關注和解決的焦點。盡管抗生素對應對細菌感染有著極大的作用和顯著的效果,但是近年來由于抗生素的不當使用和誤用,導致細菌產生抗藥性,使得多重耐藥金黃色葡萄球菌的出現再度成為嚴重的臨床問題[2]。據估計,到2050年由于感染耐藥菌死亡的人數可能達到1 000萬人[3]。因而研究人員需要開始一些新的途徑和方法來尋找替代抗生素的抗菌藥物。

近年來,金屬配合物在抗菌和抗癌等方面的良好表現,引起了藥物化學家的廣泛關注[4],比如鎵配合物對一些產生多重耐藥性的陰性菌種,如鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌,具有很強的敏感性,推測鎵配合物可能有多重靶點[5-8]。而一些金屬銅配合物也具有良好的抗菌活性,如金屬銅和駱駝寧堿形成的金屬銅配合物,它對銅綠假單胞菌的抑制圈直徑為8～19 mm,優于標準的抗菌藥阿莫西林[9-10]。另外釕的多吡啶配合物在抗菌等活性上似乎表現出良好的發展潛力,本課題組也一直致力于開發具有優良抗菌活性的多吡啶金屬配合物,例如發現[Ru(dmb)2(ETPIP)](ClO4)2(Ru(Ⅱ)-1)和[Ru(phen)2(ETPIP)](ClO4)2(Ru(Ⅱ)-2)兩種釕配合物對金黃色葡萄球菌有良好的抗菌活性(最小抑菌濃度MIC值分別為0.05 mg/mL, 0.025 mg/mL),而且金黃色葡萄球菌幾乎對其不產生耐藥性,更為重要的是,發現Ru(Ⅱ)-2配合物可以抑制代謝控制蛋白A的活性,從而導致細菌的死亡[11]。具有多種不同結構和功能的多吡啶釕配合物可以和生物分子相互作用,其與長期使用的有機抗生素相比可能表現出不同的作用機制[12],這對于應對細菌耐藥來說具有很重要的意義。釕配合物取得的諸多進展,對研究其他種類的金屬配合物帶來啟發,例如:一些鈀配合物不僅對革蘭氏陽性菌菌株表現出了良好的抗菌活性,還對陰性菌有良好的活性,比如含N-雜環卡賓的鈀配合物對革蘭氏陽性菌中的藤黃微球菌和革蘭氏陰性菌中的李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌有中等的抗菌效果(MIC值分別為0.019 7～0.062 5、0.078～1.25和1.25～5 mg/mL)[13]。鈀和釕處于同一族,是否鈀也同樣具有優異的抗菌潛力有待進一步挖掘,而關于鈀配合物抗菌方面的研究相對較少。基于此,本文設計合成了一種含有嗎啉基團修飾的三聯吡啶衍生配體及其配合物Pd1(見圖1),引入嗎啉作為功能基團是由于它是一種具有良好的理化、生物和代謝特性的雜環化合物,適當修飾的嗎啉具有廣泛的生物作用,從鎮痛、抗炎、抗氧化、抗肥胖、抗高血脂癥,到抗菌、抗神經退行性和抗癌活性等[14-17]。本團隊前期研究發現基于此配體的鉑類配合物展現出良好的抗腫瘤效果,特別是對耐順鉑細胞株同樣展現出了較好的活性抑制能力[18]。在合成及充分表征此例新結構基礎上,評估Pd1對金黃色葡萄球菌的抗菌活性及抑制生物膜的活性。考慮一些致病菌對常見抗生素耐受性的產生,本文通過棋盤法測定Pd1是否可以作為抑制致病菌對常見抗生素耐藥性產生的抗菌輔助劑,此外還測定了Pd1清除細菌分泌毒素的活性。

圖1 鈀配合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of Pd(Ⅱ) complex

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

圖1中配體4′-[4-(4-嗎啉基丁氧基)苯基]-2,2′∶6′2″-三聯吡啶根據文獻方法[19]合成,其他試劑、藥品均為市售分析純。

本研究所用儀器為:X射線單晶衍射儀(Bruker D8 VENTURE型),恒溫培養箱和恒溫培養搖床(Yiheng Scientific Instruments),酶標儀(BioTek Instruments),高分辨質譜儀(Waters Xevo G2-XS Q-TOF instrument),核磁共振儀(Bruker AVANCE 400 spectrometer)。

1.2 最小抑菌濃度(MIC)測定

測定Pd1對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。金黃色葡萄球菌在TSB培養基中培養過夜,然后用新鮮的培養基對培養過夜的菌液稀釋1 000倍,將50 μL不同濃度的Pd1和200 μL加入過夜培養菌液后的培養基混合加入96孔板中,在37 ℃下培養20 h后觀察分析結果。

1.3 生長曲線測定

使用酶標儀(800TS)測定Pd1對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。金黃色葡萄球菌在培養基中培養過夜。過夜菌液稀釋100倍,加入到24孔的平板中,在搖菌床中以220 r/min的速度培養,用酶標儀每小時測定一次菌液的OD595 nm值。

1.4 耐藥性實驗

確定Pd1具有良好的抗菌活性之后,進一步評估金黃色葡萄球菌隨著時間的變化是否會對Pd1產生耐藥性。根據文獻所提出的耐藥性實驗步驟[20],對其進行耐藥實驗,首先,對含有單一金黃色葡萄球菌的培養基培養過夜,取過夜菌10 μL然后用新的培養基對它稀釋1 000倍。向96平板加入不同濃度Pd1的含菌培養基,在37 ℃的培養箱里培養20 h,取測定值為0.5倍MIC所對應的孔中的菌液5 μL,加入無菌的培養基稀釋1 000倍,然后重復此操作傳代至20代,觀察第20代與第1代相比MIC值的倍數變化,同時采用阿米卡星作為對照。

1.5 生物膜形成的抑制

使用24孔板對Pd1進行生物膜實驗。金黃色葡萄球菌在TSB培養基里培養過夜,然后用新鮮的培養基對過夜培養的菌液稀釋1 000倍,再在24孔板中加入不同濃度含Pd1的培養基,24孔的平板在37 ℃下培養48 h,用無菌水洗去沒有黏附的細菌三次,在室溫下過夜晾干。

1.6 溶血實驗

金黃色葡萄球菌在培養基中培養過夜,將過夜菌稀釋100倍,5 mL不同濃度的含Pd1的稀釋菌液的培養基,在搖菌床中以220 r/min的速度培養13 h,測定菌液的OD值,菌液在7 000 r/min的轉速下離心,吸取菌液上清液。在EP管中加入25 μL的菌液、100 μL洗凈的兔紅細胞和1 mL的磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline, PBS)溶液。在37 ℃下培養30 min,用離心機在2 000 r/min的速度下離心。測定離心后的混合液上清液OD543 nm的值。

1.7 聯用實驗

通過棋盤法測定抗生素和Pd1之間的協同作用。金黃色葡萄球菌在培養基中培養過夜。將過夜菌液稀釋100倍,200 μL的含有稀釋菌液的培養基、25 μLPd1和25 μL抗生素以梯度稀釋的濃度加入到96孔的平板中,96孔的平板在37 ℃條件下培養20 h。

1.8 合成與表征

根據類似三聯吡啶鈀(Ⅱ)配合物合成的文獻報道[19],取4′-[4-(4-嗎啉基丁氧基)苯基)]-2,2′∶6′,2″-三聯吡啶[18](46.6 g,0.1 mmol),醋酸鈀(22.4 mg,0.1 mmol)和四丁基氯化銨(206 mg,0.7 mmol)至20 mL的圓底燒瓶中,加入7 mL乙腈,室溫下反應24 h得到綠色沉淀。反應結束后,通過旋轉蒸發儀除去乙腈,出現黏稠狀液體,加入10 mL甲基叔丁基醚后出現沉淀,將此沉淀離心,真空干燥,得到綠色配合物(Pd1)151 mg,產率80.1%。1H NMR (400 Hz, DMSO) δ 8.88-8.74(m, 4H), 8.56(d,J=5.3 Hz, 2H),8.41(d, J=7.1 Hz, 2H),8.13(d, J=8.0 Hz, 2H),7.8(d, J=6.1 Hz, 2H),7.15(d, J=8.3 Hz, 2H),4.14(s, 2H),3.59(s, 4H),3.5(s, 2H),2.39(s, 4H),1.81(s, 2H),1.63(s, 2H)。高分辨質譜(HRMS,乙腈),測試值m/z: 607.109 1,[Pd1-Cl]+(理論值607.109 2)。元素分析按C29H30ClN4O2Pd計算值(%): C 54.09, H 4.70, N 8.70; 測試值(%): C 53.84, H 4.86, N 8.61。通過甲醇揮發可得黃色晶體。通過X射線單晶衍射儀在液氮低溫條件下收集了配合物Pd1(0.19 mm×0.15 mm×0.04 mm)衍射數據,儀器配置單色石墨Mo Ka輻射衍射儀(λ=0.071 073 nm)。全部結構分析工作在SHELX2015程序完成[21]。化合物的主要晶體學數據列于表1。CCDC:2106064。

表1 Pd1的晶體和結構解析數據Table 1 Crystal and structure refinement data for Pd1

2 結果與討論

2.1 合成與表征

配合物的合成路線方案都通過圖1所示的步驟,并通過氫譜、碳譜、元素分析及高分辨質譜進行表征。用于X射線衍射晶體研究的Pd1通過甲醇揮發得到,具體的晶體結構如圖2所示,Pd1屬于單斜晶系,P21/n空間群,晶體衍射的數據收集見表1。

圖2 Pd1的晶體結構圖。(a)Pd1在三維分子結構下的熱橢球圖(30%的橢球率,省略氯離子和氫原子);(b)Pd1結構中分子的π-π堆積Fig.2 Crystal structure of Pd1. (a) Thermal ellipsoid plot of Pd1 in ORTEP view. Solvent molecules, counteranion Cl- and hydrogen atoms have been omitted for clarity; (b) intramolecular π-π stacking interactions in Pd1

圖2晶體結構表明,配合物Pd1是經典的四配位鈀配合物,其中鈀與螯合三聯吡啶配體的三個氮原子和一個氯原子結合,呈現出常見的四配位結構。如表2所示,在配合物Pd1中,四個配位鍵的鍵長分別是Pd1—Cl1為0.228 6(10) nm,Pd1-N1為0.203 6(3) nm,Pd1—N2為0.192 2(3) nm,Pd1—N3為0.202 7(3) nm,鍵角分別是N1—Pd1—Cl1為100.01(9)°,N2—Pd1—N1為80.77(11)°,N2—Pd1—N3為81.03(11)°,N3—Pd1—Cl1為98.16(9)°,總和為359.87°,接近360°,呈現出良好的平面幾何構型。同時,每個配合物分子附近有三個甲醇分子。在空間結構上,兩個分子頭尾相間,局部趨于平行,分子之間近似環中心之間的距離為0.361 5和0.391 6 nm(見圖2(b)),表明分子之間存在π-π弱堆積作用。

表2 Pd1的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and angles for Pd1

2.2 Pd1對金黃色葡萄球菌的抗菌活性

首先,為了測定引入嗎啉修飾基團的Pd1對金黃色葡萄球菌的抗菌活性,通過最小抑菌濃度MIC對Pd1進行評估,得到的MIC值為62.48 μg/mL,由此可以看出,在引入含嗎啉修飾的基團后形成的Pd1具有良好的抗菌活性。隨后,通過繪制生長曲線(見圖3),可以看出Pd1對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用,在MIC下金黃色葡萄球菌的生長明顯被抑制,此抑制活性呈現濃度依賴效應,在低濃度下(0.5倍MIC),細菌的生長受到明顯抑制。

圖3 Pd1在不同的濃度下對金黃色葡萄球菌的生長的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of Pd1 on the growth of S.aureus with different concentration

2.3 Pd1的耐藥實驗

細菌容易產生耐藥性是抗菌藥物的研發過程中面臨一項嚴峻的挑戰。為了進一步評估金黃色葡萄球菌在Pd1處理條件下是否容易對Pd1產生耐藥性,本文進行了耐藥實驗。所得實驗結果如圖4所示,發現Pd1在重復傳代20次培養之后,MIC值只增長了1倍,然而對照的抗生素阿米卡星則是增長了64倍。此結果表明Pd1不容易使金黃色葡萄球菌產生耐藥性,而且它的效果顯著。通常,化合物可能對一些與產生耐藥性有關的物質有著顯著影響,而生物膜作為產生耐藥性的重要物質,可能是其作用靶點之一。

圖4 金黃色葡萄球菌對Pd1和抗生素阿米卡星的耐受性變化,數值變化是每代最小抑菌濃度值除以第一代最小抑菌濃度值的倍數Fig.4 Resistance development of S. aureus to Pd1 and the antibiotics amikacin. Values are fold change of the MIC of each generation divided by the MIC of first generation

2.4 Pd1對易引發耐藥性的生物膜形成的抑制

生物膜是一種自我產生的將細菌菌落包含在細胞外基質的聚合物質,它黏附在生物或非生物的表面[22]。為了進一步探究Pd1是否能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成,通過對金黃色葡萄球菌表現出良好抑菌活性的Pd1來測定其對生物膜形成的影響,并通過結晶紫染色來對生物膜進行初步定量。如圖5所示,金黃色葡萄球菌在濃度為0.25倍MIC、0.5倍MIC的Pd1的培養基中培養48 h,生物膜的形成分別減少了48.7%、74.1%,這可以看出Pd1對生物膜形成的抑制是非常明顯的。生物膜的形成與細菌產生耐藥性密切相關,而通過耐藥性實驗,已經得出金黃色葡萄球菌不容易對Pd1產生耐藥性,這表明Pd1可以通過抑制生物膜的形成很好地阻止細菌耐藥性的發生,這對于開發新型抗菌藥物是非常重要的。另外值得說明的是,用于生物膜分析測定的濃度(0.25倍MIC、0.5倍MIC)對于金黃色葡萄球菌來說都是抑制性而非致死性的,都不足以殺死金黃色葡萄球菌。

圖5 Pd1分別在0、15.62和31.24 μg/mL的濃度下對金黃色葡萄球菌的生物膜形成的影響(該實驗對三個平行對照組進行測定)。(a)在24孔板中用結晶紫染色后并用50%的冰醋酸溶解后的生物膜;(b)Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的濃度下對生物膜形成抑制的數據趨勢圖Fig.5 Effect on biofilm formation of S. aureus strains with 0, 15.62 and 31.24 μg/mL of Pd1 (this experiment were investigated with three biological replicates). (a) The biofilm stained by crystal violet and dissolved with 50% of glacial acetic acid in 24-well plate; (b) the data trend graph reflected that Pd1 inhibit the formation of biofilm at different concentration of 0, 15.62 and 31.24 μg/mL

2.5 Pd1對金黃色葡萄球菌毒素的抑制

細菌毒素在細菌感染中發揮非常重要的作用,它可以通過一定的生物機制引起細胞不同形態和生理學上的變化從而導致細胞的死亡[23]。為了研究Pd1清除細菌毒素的抗菌活性,通過測定OD543 nm處的吸光度值來測定紅細胞破裂的程度。如圖6所示,紅細胞在濃度為0.25倍MIC及0.5倍MIC時,它的破損分別減少18.5%、63.7%,由此可以看出Pd1清除金黃色葡萄球菌毒素或抑制其分泌毒素的活性顯著。而細菌發揮它的毒害作用,主要是通過產生毒素,Pd1對金黃色葡萄球菌產生毒素的抑制可以阻止它對感染者造成進一步的損害。

圖6 Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的濃度下對金黃色葡萄球菌毒素的作用(該實驗對三個平行對照組進行測定)。(a)在ep管中受毒素影響兔血紅細胞的破裂程度;(b)Pd1在0、15.62和31.24 μg/mL的濃度下對毒素形成抑制的數據趨勢圖Fig.6 Effect on toxins against S. aureus with 0, 15.62 and 31.24 μg/mL Pd1 from left to right (this experiment were investigated with three biological replicates). (a) The degree of red blood cell rupture influenced by toxin in eppendorf tube; (b) the data trend graph reflected that Pd1 inhibit the formation of toxins at different concentration of 0, 15.62 and 31.24 μg/mL

2.6 Pd1與抗生素的聯用

為了克服耐藥性,包括抗菌輔助劑在內的許多方法策略被研究人員采用,許多阻止細菌對現有抗生素產生耐受性的分子可以增加細菌對金黃色葡萄球菌的敏感性。因此采用棋盤法[24]來測定Pd1和許多種來自不同類別的抗生素之間是否有聯用效果。包括鹽酸克林霉素、氨芐青霉素、氧氟沙星和阿奇霉素。金黃色葡萄球菌加入到新的培養基培養過夜,然后將過夜培養的菌液用新鮮的培養基稀釋,加入到96孔板的孔中,并按照梯度稀釋的方式用DMSO溶解Pd1以及選擇好的常見抗生素。96平板在37 ℃下培養過夜。部分抑菌濃度指數FICI(fractional inhibition concentration indices)定義為每個藥聯合使用得到的MIC除以每個藥分開使用得到的MIC之和。當FICI≥4時,兩者體現為拮抗作用,當FICI<0.5時,兩者體現為協同作用。棋盤法評估和結果如表3所示。通過測定發現鹽酸克林霉素和Pd1的FICI的值為0.375,因此兩者具有協同作用,Pd1可以增強鹽酸克林霉素對金黃色葡萄球菌的敏感性(其他幾種抗生素FICI的值均大于0.5,表現出無協同作用)。目前,研究發現了一部分抗生素作用于細菌的靶點,Pd1和鹽酸克林霉素之間的聯合作用增強了金黃色葡萄球菌對鹽酸克林霉素的敏感性,這一結果可以用來進一步研究Pd1和鹽酸克林霉素的作用靶點及作用機制之間的關聯。

表3 抗生素和Pd1聯合使用的不同抗生素的最小抑菌濃度和部分抑制濃度指數Table 3 MIC and FICI of different antibiotics used in combination with Pd1

3 結 論

本文合成了含嗎啉修飾基團的三聯吡啶鈀配合物(Pd1),它顯示出了對金黃色葡萄球菌的良好抗菌活性(MIC=62.48 μg/mL),生長曲線呈現明顯的濃度依賴,當Pd1濃度為MIC時,金黃色葡萄球菌的生長幾乎被完全抑制。更重要的是,金黃色葡萄球菌對Pd1幾乎不產生耐藥性,這可能意味著其作用于細菌的時間短、效力強。此外,還發現Pd1對抑制生物膜的生長和細菌毒素的分泌有顯著的效果,這為研究人員尋找和設計Pd1的抗菌機制提供了重要的參考。總之,Pd1表現出的優良抗菌活性表明其在抗菌方面具有極大的應用潛力,值得進一步挖掘和探索。