配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的合成、結構、HSA結合及細胞毒性

2023-10-25 02:56:18曾振芳蔡杰慧黃秋萍龐華鈺楊達欽黃秋嬋

人工晶體學報 2023年10期

曾振芳,蔡杰慧,黃秋萍,龐華鈺,楊達欽,黃秋嬋

(廣西民族師范學院化學與生物工程學院,崇左 532200)

0 引言

銅元素是人體生命活動必不可少的主要微量元素之一[1]。以金屬銅為中心絡合而成的配合物,在氧化還原的環境中擁有可調控的配位構型,應用于催化[2]、磁體[3]、生物醫藥[4]和抑菌[5]等多領域。不同的配體提供不同的配位環境,造就了配位化合物的多樣性[6]。

抗腫瘤藥物與蛋白質的特異性相互作用及其引起的蛋白質的構象變化是誘導腫瘤細胞凋亡作用機制研究的目標、內容和途徑,人血清蛋白(human serum albumin, HSA)是血漿中含量豐富的蛋白質,由于HSA重要的生理功能和易于分離、提純的特性,因而常被作為模型物質用于研究生物大分子與藥物小分子間的相互作用[7]。鉑類配合物已經作為抗腫瘤藥物應用于臨床多年[8],順鉑開辟了金屬配合物在抗癌領域的研究,順鉑之后,卡鉑、奧沙利鉑等也應用于臨床[9-10],但是鉑類配合物因為毒副作用及耐藥性等問題,在臨床使用上受到限制[11]。銅可通過多種機制誘導細胞死亡,包括活性氧積累、細胞凋亡、蛋白酶體抑制和線粒體功能障礙等[12],但是目前報道的銅配合物的抗腫瘤活性不大。為了開發和發展新型具有抗腫瘤活性且毒性較小的金屬銅配合物,本文合成了一個新型配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2},通過紅外、元素分析及單晶XRD等方法對配合物進行表征,研究了{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的紫外及熒光性質,與HSA的相互作用方式和其對胃癌細胞A549、宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞LO2細胞的增殖抑制能力。

1 實驗

1.1 實驗主要儀器、試劑

實驗儀器:Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer),Smart ApexII CCD X 型X射線單晶衍射儀(德國 Bruker),Multiskan Spectrum型酶標儀(美國Thermo),RF-5301 PC型熒光分光光度計(日本島津),UV-8000型紫外可見分光光度計(上海分析儀器有限公司),VarioEL III元素分析儀(德國艾樂曼)。

實驗試劑:三羥甲基氨基甲烷(Tris)、濃鹽酸、對氯苯甲酸(分析純,上海阿拉丁生化科技),三水合硝酸銅(分析純,天津市光復科技),甲醇(分析純,成都市科龍化工),HSA(純度99%,Sigma),A549、Hela、HepG2和LO2(中國科學院細胞庫)。

1.2 配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的合成

稱取0.070 5 g(0.45 mmol)對氯苯甲酸溶于5.0 mL甲醇中。稱取0.024 2 g (0.1 mmol)三水合硝酸銅溶于10.0 mL甲醇中。攪拌下,將硝酸銅甲醇溶液滴入對氯苯甲酸溶液中,結束后,溶液為深藍透明態,室溫下攪拌反應30 min后置于燒杯中,用保鮮膜封好,扎3～4個小孔,室溫放置23 d,有塊狀淡藍色晶體析出。將晶體過濾后,在60 ℃干燥箱中烘干。{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的分子式為C30H22Cl4Cu2O10,相對分子質量MW=811.35。元素分析理論值(%):C 44.41, H 2.73;實驗值(%):C 44.25, H 2.80。

1.3 配合物的表征

1.3.1 紅外光譜

在瑪瑙研缽中將溴化鉀研細,以1∶100(質量分數)的比例,將配合物與溴化鉀研磨至完全混合狀態,壓片。在波長為4 500～400 cm-1下,使用Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀對配合物樣品片進行紅外掃描。

1.3.2 晶體結構

在光學顯微鏡下,挑選大小為0.30 mm×0.26 mm×0.18 mm、表面光滑的晶體,293(2) K下,于Smart ApexII CCD X 型X射線單晶衍射儀上,用Cu-Kα(λ=0.154 184 nm)光源進行衍射掃描,角度范圍為7.033°<θ<76.314°,在-8≤h≤7,-13≤k≤13,-15≤l≤15的衍射區中收集數據,對配合物晶體進行X單晶衍射。利用SHELXL 97和SHELXS 97[13]程序解析晶體結構,氫原子均為理論加氫。配合物的晶體學、主要鍵長與鍵角數據分別列于表1、表2。CCDC: 2104588。R(int)=0.021 0,R1=0.040 0,wR2=0.114 5。

表1 配合物的主要晶體學參數Table 1 Crystallographic data of complex

表2 配合物的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and bond angles of complex

1.4 配合物晶體的紫外和熒光性質

1.4.1 紫外光譜

稱取0.016 2 g (20.0 μmol)樣品溶解于20.0 mL DMSO溶液中,配置成濃度為1.0×10-3mol·L-1的溶液。對半稀釋成5.0×10-4、2.5×10-4、1.25×10-4、6.25×10-5、3.125×10-5、1.562 5×10-5、7.812 5×10-6mol·L-1。在波長為200～700 cm-1下,用UV-8000型紫外可見分光光度計對配制的8個濃度的樣品溶液進行紫外吸收掃描。

1.4.2 熒光光譜

室溫下,設置激發波長為326 nm,發射波長為343 nm,在波長為320～400 cm-1下,用RF-5301 PC型熒光分光光度計(日本島津)對上述配制的8個濃度配合物溶液進行熒光掃描。

1.5 配合物晶體與HSA的相互作用

1.5.1 溶液配制

Tris-HCl/NaCl(pH=7.4)緩沖溶液[14-15]:稱取0.605 7 g(5 mmol)的Tris和2.910 2 g(0.05 mol)的NaCl加入燒杯中,加入適量雙蒸水,攪拌至完全溶解,轉移至容量瓶(1.0 L)中,用濃鹽酸調節至所需pH值,定容,備用。HSA(2.0 mmol·L-1)溶液[16-17]:將適量HSA用上述緩沖溶液溶解,測定其在280 nm處的吸光度值A280,按照式HSA=K×A280/35 700(mol/L)計算出稀釋倍數,K為稀釋所需濃度的倍數,用緩沖溶液稀釋,備用。配制好的溶液存放于4 ℃下,3 d內使用。

1.5.2 紫外光譜

樣品池和空白池中各放入2.5 mL緩沖溶液,進行系統基線校準。緩沖溶液換成溶劑,去除溶劑影響。樣品池中溶劑換成2.5 mL的HSA (2.0 mmol·L-1)溶液,在波長為190～450 nm下進行紫外光譜掃描。使用移液槍將40 μL的配合物(50.0 μmol·L-1)分別加入到樣品池和空白池中,每次滴加后,吹打混勻,充分與HSA反應5 min,進行紫外光譜掃描。

1.5.3 熒光光譜

樣品池中加入2.5 mL的 HSA(5 μmol·L-1)溶液,尋找到最優激發波長(λex=295 nm)。在波長范圍 220～450 nm中掃描。用移液槍向樣品池中加20 μL的配合物(1.2 mmol·L-1)溶液,與HSA充分反應5 min后,進行熒光光譜掃描。

1.6 Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗

將LO2、HepG2、Hela和A549細胞復蘇、傳代后,配制成細胞懸液,在96孔細胞培養板中每孔加入5×103個細胞,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養20～24 h,每孔加入100 μL配合物溶液,培養48 h,棄上清液,用培養液洗滌細胞后用CCK-8染色,用酶標儀測定OD值(λ=450 nm),每種濃度設3個平行實驗。

2 結果與討論

2.1 配合物的結構

2.1.1 紅外光譜分析

2.1.2 晶體結構分析

配合物部分鍵長、鍵角列于表2,分子晶體結構如圖2所示。

圖2 配合物的晶體結構圖Fig.2 Crystal structure of complex

2.2 配合物的紫外與熒光性質

2.2.1 紫外光譜分析

由圖3紫外吸收譜圖顯示,在200～700 nm,當配合物濃度減小,紫外吸收強度降低,且最大吸收峰有藍移現象。圖4顯示波長308 nm處為配合物的最大吸收峰,261 nm處為對氯苯甲酸的最大吸收峰,251 nm處為三水硝酸銅的最大吸收峰。從圖中可以看出,配合物的最大吸收峰出現在不同于原料的位置,可以推斷合成了新物質。

圖3 不同濃度配合物的紫外可見吸收圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of complexes with different concentrations

圖4 原料與配合物的紫外可見吸收圖Fig.4 UV-Vis absorption spectra of raw material and complex

2.2.2 熒光光譜分析

從圖5可以看出,配合物的最大吸收峰出現在波長266 nm處,三水合硝酸銅最大吸收峰在波長290 nm處,對氯苯甲酸最大吸收峰出現在波長294 nm處。配合物跟原料的最大吸收峰波長所處位置及峰型不同,進一步說明合成了新物質。從圖6中可以看出,配合物濃度越小,在最大吸收峰處的熒光強度越大。

圖5 原料與配合物的熒光圖Fig.5 Fluorescence spectra of raw material and complex

2.3 配合物對HSA的互相作用

2.3.1 紫外光譜分析

HSA含有α-螺旋和無規則卷曲,會產生紫外吸收。α-螺旋發生變化與酪氨酸殘基、色氨酸殘基和苯并氨酸殘基中的共軛雙鍵發生π-π*躍遷,使金屬配合物與HSA作用后紫外光譜發生峰位移動、強度變化等,可以根據該現象來判斷配合物是否與HSA發生相互作用[18]。由圖7可知,強吸收峰出現在267 nm處,當配合物的濃度增大時,紫外吸收強度降低,由此可見,配合物與HSA發生了相互作用。

圖7 不同濃度配合物與HSA作用的紫外可見吸收圖Fig.7 UV-Vis absorption spectra of the interaction between the complex with different concentrations and HSA

2.3.2 熒光光譜分析

HSA的熒光性源于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,當激發波長為 295 nm 時,HSA 的熒光全部來源于色氨酸殘基[19]。由圖8可以看到,HSA在強吸收峰326 nm處。吸收強度隨著配合物濃度增大而降低。如圖9所示,在不同的r值下,初始熒光強度為90.64%,配合物加了400 μL后,體系中的熒光強度為60.03%,HSA的熒光強度減弱值為30.61%。根據公式(1)和(2)[20-21]:

圖8 不同濃度配合物與HSA作用的熒光圖Fig.8 Fluorescence spectra of the interaction between the complex with different concntrations and HSA

圖9 (F/F0×100%)-r的關系圖Fig.9 Relationship of (F/F0×100%) and r

F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C]

(1)

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[C]

(2)

式中:F0和F分別表示未加入和加入配合物時EB-CT-DNA體系的熒光強度,[C]表示配合物濃度,Ka是結合常數,n是結合位點數,τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命,猝滅常數Ksv=5.78×103L·mol-1,猝滅速率常數Kq=Ksv×108=5.78×1011L·mol-1·s-1,Kq>2×1010L·mol-1·s-1,可知配合物能夠靜態猝滅HSA熒光的熒光強度。如圖8所示,得出配合物和HSA的結合常數Ka=1.38×102L·mol-1,結合位點數n=0.592。

2.4 CCK-8實驗

配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對A549、Hela、HepG2和LO2細胞作用48 h后細胞的半抑制濃度(IC50)值見表3。從表中可以看出,配合物對4種細胞都具有抗增殖作用,相同條件下,{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對3種癌細胞的抗增殖效果遠遠大于配體pcba,抗癌效果跟順鉑相當,對人正常肝細胞LO2細胞毒性比順鉑小,對Hela、A549、HepG2的細胞抑制毒性效果比文獻報道的同類銅配合物好[19]。{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對4種細胞的毒性作用順序為Hela>A549>HepG2>LO2。