基于響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵酸奶制作工藝

曹蒙,周舟,靳羽慧,謝歡歡,李建芳,周楓

(信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院,河南 信陽464000)

酸奶是一種深受人們偏愛的發(fā)酵乳制品。在發(fā)酵過程中,酸奶中大分子碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解成小分子物質(zhì),蛋白質(zhì)凝結(jié)形成小分子的乳塊[1],便于人體消化和吸收,促進(jìn)人體生長(zhǎng),乳酸菌能有效地抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[2],從而抑制腸癌。

植物乳桿菌屬于乳酸菌的一種[3],是人體胃腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群,通過代謝產(chǎn)生有機(jī)酸等有益物質(zhì)。大量研究證明,植物乳桿菌能和各類碳水化合物、肽鏈結(jié)構(gòu)以及許多氨基酸等物質(zhì)形成功能性成分[4],能夠加強(qiáng)人體對(duì)酸奶中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。植物乳桿菌在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,如果酒、飲料、乳制品等,其不僅可以增加產(chǎn)品粘稠度、改善風(fēng)味,能一定程度上抑制致病菌[5-6],并提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性。

本試驗(yàn)選用植物乳桿菌JYLP-002作為發(fā)酵劑,以接種量、蔗糖濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間作為主要考察因素,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn),確定植物乳桿菌JYLP-002凝固型酸奶最佳發(fā)酵工藝,最后對(duì)凝固型酸奶進(jìn)行酸度、蛋白質(zhì)、持水力等理化指標(biāo)測(cè)定,同時(shí),對(duì)其進(jìn)行質(zhì)構(gòu)品質(zhì)分析,以期獲得一種營(yíng)養(yǎng)成分高、感官質(zhì)量良好的凝固型酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌JYLP-002,鄭州百益寶生物技術(shù)有限公司;純牛奶,內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;蔗糖,購(gòu)買于信陽農(nóng)林學(xué)院西亞和美超市;95%乙醇,環(huán)球科技創(chuàng)新有限公司;鹽酸,開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酚酞,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;冰乙醇,天津大茂化學(xué)試劑廠;葡萄糖,中國(guó)天津市巴斯夫有限公司;硫酸銅,中國(guó)天津市巴斯夫有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C智城超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司;LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;JY1002電子天平,上海越平科學(xué)儀器制造有限公司;LDL-40B低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;ST-04自動(dòng)凱氏定氮儀,山東盛泰儀器有限公司;TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀,北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.3 酸奶的制作

1.3.1 工藝流程 純牛奶→預(yù)熱→添加蔗糖→冷卻→接種→混合均勻→裝瓶→發(fā)酵→后熟→發(fā)酵乳。

1.3.2 操作要點(diǎn) (1)菌種活化:采用直投式乳酸菌混合菌種。將斜面保藏的植物乳桿菌接種在MRS肉湯中活化,2次繼代培養(yǎng)后,于37℃條件下培養(yǎng)24 h,激活植物乳桿菌。

(2)調(diào)配殺菌:將純牛奶在90℃～95℃條件下預(yù)熱殺菌5 min,添加蔗糖溶于其中,并攪拌均勻,繼續(xù)滅菌處理5 min后,冷卻過濾;

(3)接種發(fā)酵:接種活化好的發(fā)酵劑,接種完畢后混合均勻,無菌灌封,放置在一定發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵28h;

(4)后熟:發(fā)酵結(jié)束后,在2～6℃條件下,后發(fā)酵4h即成凝固型酸奶。

1.3.3 酸奶感官評(píng)定方法 參照GB19302-2010[7]中的感官評(píng)分要求及朱奇奇[8]的酸奶評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),選擇10名專業(yè)人員分別對(duì)酸奶的組織形態(tài)、芳香氣味、滋味口感以及酸甜度進(jìn)行打分。具體感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 植物乳桿菌接種量 在滅菌乳中添加6.0%的蔗糖,冷卻后分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的植物乳桿菌JYLP-002,混合均勻后裝瓶,在35℃下發(fā)酵28 h,后發(fā)酵4 h,然后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.4.2 蔗糖濃度 在滅菌乳中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%,5.0%,6.0%,7.0%,8.0%的蔗糖,冷卻后接入2.0%的植物乳桿菌JYLP-002,混合均勻后裝瓶,在35℃下發(fā)酵28 h,后發(fā)酵4 h,然后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.4.3 發(fā)酵溫度 在滅菌乳中添加6.0%的蔗糖,冷卻后接入2.0%的植物乳桿菌JYLP-002,混合均勻后裝瓶,分別在25、30、35、40、45℃的條件下發(fā)酵28 h,后發(fā)酵4 h,然后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.4.4 發(fā)酵時(shí)間 在滅菌乳中添加6.0%的蔗糖,冷卻后接入2.0%的植物乳桿菌JYLP-002,混合均勻后裝瓶進(jìn)行發(fā)酵,在35℃下分別發(fā)酵20、24、28、32、36 h,后發(fā)酵4 h,然后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,挑選三個(gè)影響較大的因素,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),將感官評(píng)分作為響應(yīng)值,確定酸奶的最佳配方。響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平表

1.6 理化指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 酸度的測(cè)定 選用GB5009.239-2016[9]中乳及其他乳制品酸度的測(cè)定方法。

1.6.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定 選用GB5009.5-2016[10]中凱氏定氮法。

1.6.3 持水力的測(cè)定 參照劉亞瓊[11]的測(cè)定方法,取10 mL酸奶放入離心管。使用電子天平稱量離心管質(zhì)量記W1,加入酸奶后的總質(zhì)量記為W2,3000 r/min,離心10 min,靜置10 min,去除上清液后,剩余質(zhì)量記為W3。

持水力(%)=[(W3-W1)/(W2-W1)]×100%

1.7 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

采用TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀對(duì)酸奶進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析,具體方法如下:將酸奶放置于室溫(25℃)下一段時(shí)間,選擇直徑為40mm的圓形探頭,以50%的形變量、20N的力量感應(yīng)元、0.01N的觸發(fā)力、1.00mm/s的測(cè)試速度,選擇下壓模式,測(cè)得酸奶的彈性、膠粘性和咀嚼性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)差異性顯著分析,采用Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果分析

2.1 接種量對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

由圖1可知,隨著接種量的增加,酸奶的感官評(píng)分先升高后降低,當(dāng)接種量達(dá)到2%時(shí),酸奶感官評(píng)分最高,此時(shí)酸奶酸甜度適中,口感細(xì)膩順滑,組織良好,無乳清析出;當(dāng)接種量超過2%時(shí),感官評(píng)分隨之降低。這可能是因?yàn)樽畛趸罹鷶?shù)較少,酸奶發(fā)酵不成功,呈現(xiàn)比較稀的狀態(tài),即組織狀態(tài)差、伴有有乳清析出等[12];菌種接種量添加過多造成酸奶酸度過高,感官評(píng)分降低。因此,本試驗(yàn)最適接種量為2%～3%。

圖1 接種量對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響 圖2 蔗糖濃度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

2.2 蔗糖濃度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

由圖2可知,隨著蔗糖濃度的增加,酸奶的感官評(píng)分先升高后降低,當(dāng)蔗糖的濃度達(dá)到6%時(shí),酸奶感官評(píng)分達(dá)到最高,該條件下發(fā)酵的酸奶組織狀態(tài)良好,無乳清析出,酸甜度適中,這是因?yàn)榘l(fā)酵體系中具有充足的能量能夠不斷促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)發(fā)酵,使其酸度適中、組織狀態(tài)良好[13];繼續(xù)增加蔗糖濃度,酸奶的感官評(píng)分持續(xù)降低,這可能是因?yàn)樘砑舆^量的蔗糖在一定程度上阻礙了菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收[21],從而抑制植物乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖。因此,適宜蔗糖濃度為6%左右。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

由圖3可看出,隨著發(fā)酵溫度的升高,酸奶的感官評(píng)分先升高后降低,當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到30℃時(shí),感官評(píng)分最高,此時(shí)酸奶產(chǎn)酸的能力強(qiáng),組織結(jié)構(gòu)和風(fēng)味良好;當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高,感官評(píng)分隨之降低。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度較低,菌種的活性不夠,解乳糖產(chǎn)生乳酸的速率下降;而發(fā)酵溫度過高時(shí),菌種生長(zhǎng)初期生長(zhǎng)速率過快,導(dǎo)致酸奶產(chǎn)酸過快、蛋白質(zhì)聚集顆大[15]。因此,酸奶的最適發(fā)酵溫度在30℃左右。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響 圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵乳的影響

由圖4可看出,酸奶的感官評(píng)分表現(xiàn)為先上升后下降,發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 h,酸奶感官評(píng)分最高,隨后感官評(píng)分下降。在酸奶發(fā)酵過程中,在一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠化程度越來越高,酸奶的凝固狀態(tài)也越好,粘度增大[16]。因此,酸奶適宜發(fā)酵時(shí)間為28 h。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,挑選三個(gè)影響較大的單因素,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),將感官評(píng)分作為響應(yīng)值,確定植物乳桿菌酸奶的最佳配方。試驗(yàn)方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析表

采用Design-Expert8.0.6響應(yīng)設(shè)計(jì)軟件,選擇感官評(píng)分作為響應(yīng)值,對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合。得到感官評(píng)分(Y)對(duì)接種量(A)、蔗糖濃度(B)和發(fā)酵溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程模型為:

Y=92.72+0.82A-1.38B-0.61C-3.085AB+1.48AC-0.14BC-3.27A2-6B2-11.49C2

為檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)酸奶感官評(píng)分?jǐn)?shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表4所示。從表4可以看出,模型的P值<0.01,表明該模型差異影響極顯著,失擬項(xiàng)P值=0.0992>0.05,不顯著,表明該回歸擬合度高。模型中一次項(xiàng)接種量(A)差異顯著(P<0.05),蔗糖濃度(B)差異極顯著(P<0.01)。在交互項(xiàng)中,因素AB與AC均為極顯著(P<0.01)。通過比較F值的大小可以得知三種因素對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響程度依次為:蔗糖濃度(B)>接種量(A)>發(fā)酵溫度(C)。

表4 方差分析

2.5.2 感官評(píng)分的響應(yīng)面分析 使用Design-Expert8.0.6軟件作出3個(gè)因素之間的響應(yīng)曲面圖,如圖5所示。

響應(yīng)曲面三維空間曲面的變化和等高線反映各因素的交互作用,三維空間曲面圖越陡峭,說明響應(yīng)值影響越顯著[27],等高線表示同一區(qū)域內(nèi),接近圓形表明交互作用不明顯可以忽略,反之橢圓形表明交互作用顯著[28]。由圖5可知,隨著A(接種量)和B(蔗糖濃度)的增加,酸奶的評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),B顯示的坡度比A的陡峭,所以B對(duì)酸奶感評(píng)分的影響程度大于A,等高線呈橢圓形,表示A和B交互作用顯著;隨著A(植物乳桿菌JYLP-002接種量)和C(發(fā)酵時(shí)間)的增加,酸奶的評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),A顯示的曲面坡度比C的陡峭,所以A對(duì)酸奶感評(píng)分的影響程度大于C,等高線呈橢圓形,表示A和C交互作用顯著;隨著B(蔗糖濃度)和C(發(fā)酵時(shí)間)的增加,酸奶的評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),B顯示的曲面坡度比C的陡峭,所以B對(duì)酸奶感評(píng)分的影響程度大于C,等高線呈圓形,表示B和C交互作用不顯著。

2.5.3 最佳工藝條件的優(yōu)化 通過Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵條件和響應(yīng)數(shù)據(jù)為:接種量2.6%,蔗糖濃度5.9%,發(fā)酵溫度32℃。為檢驗(yàn)該條件的可靠性,經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)得到的植物乳桿菌JYLP-002發(fā)酵酸奶感官評(píng)分為93.41±1.04,與理論預(yù)測(cè)值接近,說明采用響應(yīng)面分析法得到的最佳工藝條件是可靠的。

2.5.4 理化指標(biāo)測(cè)定 接種量2.7%、蔗糖濃度5.9%、發(fā)酵溫度32℃制作出的酸奶酸度為(74.27±0.68)°T、蛋白質(zhì)含量(2.73±0.21)%,符合GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的要求。酸奶的持水力為(84.63±0.58)%,成品酸奶在冷藏期間的未出現(xiàn)乳清析出現(xiàn)象, 成品酸奶的品質(zhì)較好[30]。彈性為(30.62±1.35)mm、膠粘性為(0.1003±0.0041)N、咀嚼性為(3.09±0.96)mj,呈現(xiàn)出組織細(xì)膩、質(zhì)地均勻的狀態(tài)。綜合各項(xiàng)因素,響應(yīng)面優(yōu)化工藝發(fā)酵得到的酸奶質(zhì)量好。

3 結(jié)論

以牛乳為主要原料,植物乳桿菌JYLP-002為發(fā)酵菌種,利用單因素設(shè)計(jì)以及Box-Behnken響應(yīng)面分析原理建立二次多項(xiàng)回歸方程模型,模型顯示感官質(zhì)量與酸奶發(fā)酵工藝之間并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而存在顯著交互作用。最終確定植物乳桿菌JYLP-002發(fā)酵酸奶最佳工藝:接種量2.6%,蔗糖濃度5.9%,發(fā)酵溫度32℃。此條件下發(fā)酵得到的酸奶組織狀態(tài)良好,口感細(xì)膩,酸奶酸度為(74.27±0.68)°T,蛋白質(zhì)含量(2.73±0.21)%,均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本研究為植物乳桿菌JYLP-002發(fā)酵酸奶的開發(fā)利用提供依據(jù)。