霧水葛總黃酮涂膜劑的制備及抗氧化研究

吳冬凡,丁 瑩

(廣東藥科大學 廣東省化妝品工程技術研究中心,廣東 廣州 510006)

霧水葛Pouolia seylanic (L.) Benn.為蕁麻科霧水葛屬植物,是我國南方地區一種常用的民間草藥。霧水葛以全草入藥,有消腫祛膿、清熱解毒、利水通淋的功效,主要用于急性乳腺炎以及各種化膿性皮膚感染的治療。目前研究發現其活性成分主要有黃酮類[1]、木脂素類[2]、揮發性成分[3]、生物堿[4]等。現代研究表明,霧水葛具有抗炎鎮痛[5]、抗皮膚潰瘍[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10]等作用。

黃酮類化合物有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、降血壓、降血糖等藥理作用。陳卓翰[11]采用金黃色葡萄球菌誘導小鼠皮下膿腫模型評價總黃酮提取物對化膿性皮膚細菌感染的療效。實驗結果表明,總黃酮提取物能抑制皮下膿腫的增長,促進傷口愈合,是該植物的活性部位。因此本課題選取霧水葛總黃酮作為原料,利用正交試驗探討其涂膜劑的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料 霧水葛藥材采摘自中山市廣東藥科大學中山校區,經廣東藥科大學田素英老師鑒定為蕁麻科霧水葛屬霧水葛Pouzolziazeylanica(L.) Benn.的全草。白及藥材購于中山市中智中藥飲片有限公司。所用菌種為綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(由中國藥品生物制品檢定所提供)。

1.1.2 實驗試劑 蘆丁標準品(成都埃法生物科技有限公司,批號:153.18.4),DPPH(上海如吉生物科技發展有限公司,批號:1898-66-4),其余試劑均為分析純。

1.1.3 實驗儀器 721型分光光度計(株式會社日立制作所,U-3900),電子天平(上海恒平科學儀器有限公司,JA2003),多功能高速中藥粉碎機(溫州頂歷醫療器械有限公司,DFT-150)。

1.2 實驗方法

1.2.1 霧水葛總黃酮的提取與大孔樹脂純化 取300g粗粉,以10倍量石油醚回流1h,過濾后再用8倍量石油醚回流1h,濾液經紗布過濾后以8倍量的70%乙醇回流3次,每次1h,合并乙醇濾液,用旋轉蒸發儀減壓濃縮至100mL,離心,取上清液,再加蒸餾水配置成0.3g生藥/mL的溶液,調節溶液pH=5,然后先往AB-8大孔樹脂柱加入150mL的提取液,控制好流速為60mL/h,過柱后用60mL蒸餾水洗除去雜質,再用60mL 60%乙醇洗脫,收集60%乙醇提取液[12]。

1.2.2 PVA-124預處理和白及膠漿制備 稱取PVA-124,用適量85%的乙醇浸泡過夜,濾過,重復3次以上,烘干備用;取適量白及,粉碎,加10倍量蒸餾水浸泡至少2天,溫度控制在4℃左右,不定期攪拌,用紗布濾過,濾液加乙醇,調節含醇量為70%～80%,靜置過夜,單層紗布過濾,將得到的絮狀沉淀物干燥,即得白及膠。然后稱取適量的白及干膠加10倍量的蒸餾水,水浴加熱并攪拌使其充分溶解,得白及膠漿備用[13]。

1.2.3 單因素考察 為優選霧水葛涂膜劑的最佳制備工藝,在查閱了涂膜劑的相關文獻的基礎上,進行單因素試驗,主要考察成膜材料PVA-124和白及膠漿,增塑劑甘油,乳化劑吐溫-80,增強劑可溶性淀粉五個因素對涂膜劑成膜性能的影響,以成膜時間和外觀質量為指標,做出霧水葛涂膜劑成膜時間和外觀質量隨各個因素用量變化的圖表,觀察其變化趨勢,以進一步縮小各成分的用量范圍[14],為下一步正交試驗提供合適數據。

(1)各因素的考察。固定處方中的白及膠漿、甘油、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,然后分別加入5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g PVA-124以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水中,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、甘油、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,分別加入2g、3g、4g、5g、6g、7g白及膠漿以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、吐溫-80、可溶性淀粉的用量,分別加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g甘油以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、甘油、可溶性淀粉的用量,分別加入0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g吐溫-80以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

固定處方中的PVA-124、白及膠漿、甘油、吐溫-80的用量,然后分別加入0g、0.25g、0.50g、0.75g、1.00g、1.25g可溶性淀粉以及2g總黃酮提取物于50mL蒸餾水,在80～90℃下加熱并攪拌20min,靜置至無氣泡,即得霧水葛涂膜劑。

(2)評分標準。總分=外觀質量+(15-成膜時間)。外觀質量:分散度2.5分;透明度2.5分;韌性2.5分;可揭布性2.5分。成膜時間:取涂膜劑適量均勻涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以min為單位,觀察并記錄成膜時間[15]。

1.2.4 正交試驗設計 根據PVA-124(A)、白及膠漿(B)、甘油(C)、吐溫-80(D)和可溶性淀粉(E)的單因素試驗結果,以涂膜劑的成膜時間和外觀質量為考察指標,,進行L16(45)正交試驗,因素和水平如表1所示。

表1 L16(45)正交試驗因素水平 (g)

總分=外觀質量+(10-成膜時間)

外觀質量:分散度2.5分;透明度2.5分;韌性2.5分;可揭布性2.5分。

成膜時間:取涂膜劑適量均勻涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以分鐘為單位,觀察并記錄成膜時間。

1.2.5 實驗操作 按上述正交試驗優選出來的配比制備三批霧水葛涂膜劑,測定三批樣品的成膜時間以及外觀質量,進行評分。

1.2.6 霧水葛總黃酮涂膜劑的抑菌作用考察 (1)培養基的制備。按照瓊脂培養基和營養肉湯培養基的說明書,按比例準確稱取固體瓊脂粉和固體營養肉湯粉末于錐形瓶中并加入蒸餾水至250mL,用牛皮紙進行封口,并用立式壓力蒸汽滅菌器在121℃下滅菌20min,取出后降溫至合適溫度即可將瓊脂培養基在超凈工作臺上進行倒平板操作,冷卻后倒置平板,并用紫外線滅菌。

(2)菌種的活化與菌液的制備。在超干凈工作臺上點燃酒精燈,然后將接種環灼燒冷卻后蘸取綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種,分別在已經制備好的瓊脂培養基上進行平板劃線操作。劃線完成后將各菌種在最適溫度下進行培養24h。取出培養基后用接種環挑取有活力的菌落再次重復上述操作,活化兩次,然后在超凈工作臺用接種環挑取有活力的菌落里接入新鮮配制的營養肉湯中,用搖床進行培養24h[16]。將營養肉湯通過連續稀釋平板計數法,稀釋成108CFU。

(3)抑菌活性的測定。用打孔器將濾紙片打出多個小圓片并進行滅菌處理,將其浸泡在50mg/mL總黃酮濃度的樣品溶液和100mg/mL總黃酮濃度的樣品溶液中,同時設置空白組和陽性對照組;取0.1mL稀釋到108CFU/mL的三種菌液,用移液槍注入培養基中,用涂布棒進行均勻涂布(每次涂布前都需將涂布棒灼燒滅菌并冷卻)[17]。將培養基分成四個部分,做好標記,將樣品組、空白組和陽性對照組小圓片按標記放貼在各個區域的中心,用鑷子輕輕按壓小圓片。封口后,放入恒溫培養箱,于各菌種最佳培養溫度培養1個生長周期。待培養基上長出菌落后,測量抑菌圈直徑[18]。重復實驗多次,結果以(均值±標準差)的形式表示。

1.2.7 霧水葛總黃酮涂膜劑的抗氧化作用考察 (1)DPPH自由基清除率的測定。DPPH自由基可以溶解在乙醇中,形成紫色的溶液,在517nm處有特征吸收。加入黃酮類化合物時,黃酮苯環上的酚羥基的H原子將與DPPH自由基的未成對電子配對[19],溶液顏色變為黃色。所以通過517nm處吸光度的變化,就可以黃酮對DPPH 自由基的清除效率。

配制以下溶液:3×10-4mol/L的DPPH-無水乙醇溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的樣品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

取樣品溶液2mL和DPPH-無水乙醇溶液2mL,搖勻,靜置0.5h。無水乙醇調零,在517nm測定吸光度,記為A0;取樣品溶液2mL和無水乙醇2mL,搖勻,靜置0.5h。無水乙醇調零,在517nm測定吸光度,記為A1;取無水乙醇2mL和DPPH-無水乙醇溶液2mL,搖勻,靜置0.5h。無水乙醇調零,在517nm測定吸光度,記為A2。

以Vc溶液為陽性對照;根據公式1計算DPPH自由基的清除率。

(公式1)

(2)還原能力的測定。配制以下溶液:0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的樣品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

分別將各濃度樣品溶液2mL、1% K3[Fe(CN)6]溶液2mL、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液2mL加10mL試管中,蒸餾水定容,搖勻,在50℃下反應0.5h,反應之后與2mL10%三氯乙酸混勻,靜置10min,5 000r/min高速離心5min,取上清液2mL,加入2mL蒸餾水、0.5mL0.1% FeCl3溶液,搖勻,反應10min,測定700nm下的吸光度,記為A1;以2mL蒸餾水代替樣品溶液重復上述實驗,吸光度記為A0;樣品+緩沖液+蒸餾水(加入量=鐵氰化鉀+三氯乙酸+蒸餾水+三氯化鐵的總量),重復上述實驗,吸光度記為Aj;以Vc為陽性對照品,比較Vc和樣品的還原能力[20]。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 PVA-124的影響 從表2可知,隨著PVA-124用量的增加,成膜時間呈現變大的趨勢,外觀質量也在下降,這是因為過大質量分數的PVA-124已經出現飽和,濃稠的混合物阻礙水分的揮發,致使成膜時間越來越長;配成的溶液也隨著質量分數的變大越來越渾濁,形成的膜也含有許多未溶解的物質。綜上所述,選擇5.0g、5.5g、6.0g、6.5g的PVA-124進行正交試驗。

表2 不同用量PVA-124制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數

2.1.2 白及膠漿的影響 從表3可知,隨著白及膠漿用量的增加,成膜時間呈現變大的趨勢,外觀質量也在下降,這是因為過大質量分數的白及膠漿已經出現飽和,濃稠的混合物阻礙水分的揮發,致使成膜時間越來越長;配成的溶液也隨著質量分數的變大越來越渾濁,形成的膜也同樣含有許多未溶解的物質。綜上所述,選擇2.0g、3.0g、4.0g、5.0g的白及膠漿進行正交試驗。

表3 不同用量白及膠漿制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數

2.1.3 增塑劑甘油的影響 從表4可知,從成膜時間上看,隨著甘油質量分數的增加,各個處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時間呈現先減少后增加的趨勢,可見甘油的質量分數對涂膜劑成膜時間有一定影響。甘油質量分數大于5.0%時,膜十分柔軟,甚至有少量甘油析出,外觀質量下降;當甘油質量分數小于2.0%時,膜薄、易撕開,原因可能是甘油質量分數小,不能很好地增加膜的塑形。綜上所述,選擇1.0g、1.5g、2.0g、2.5g的甘油進行正交試驗。

表4 不同用量甘油制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數

2.1.4 乳化劑吐溫-80的影響 從表5可知,從成膜時間上看,各個處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時間無明顯規律,但有變化,可見吐溫-80的質量分數對涂膜劑成膜時間有一定影響。吐溫-80質量分數大于2.0%時,膜表面有較多顆粒析出,外觀質量下降;當甘油質量分數小于0.8%時,膜薄,水溶性不好,原因可能是吐溫-80質量分數小,不能很好地降低表面張力,使其更易溶于水。綜上所述,選擇0.4g、0.6g、0.8g、1.0g的吐溫-80進行正交試驗。

表5 不同用量吐溫-80制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數

2.1.5 增強劑可溶性淀粉的影響 從表6可知,從成膜時間上看,各個處方制成的霧水葛涂膜劑的成膜時間無明顯規律,但有變化,可見可溶性淀粉的質量分數對涂膜劑成膜時間有一定影響。可溶性淀粉質量分數大于2.0%時,膜的表面有大量小顆粒析出,外觀質量下降;而且由于可溶性淀粉的增強效果,使得薄膜與玻璃板之間的黏著力增大,不易揭開。可溶性淀粉質量分數小于0.5%時,形成的膜較薄,易撕開。綜上所述,選擇0.25g、0.50g、0.75g、1.00g的可溶性淀粉進行正交試驗。

表6 不同用量可溶性淀粉制得的霧水葛總黃酮涂膜劑的參數

2.2 正交試驗結果

結果見表7和表8。

表7 正交設計表及試驗結果

表8 以綜合評分為指標的方差分析

從成膜時間為指標的極差看出,5個因素對成膜時間的影響A>E>C=D>B;從外觀質量為指標的極差看出,5個因素對外觀質量的影響A>B>D=E>C;從綜合評分為指標的極差看出,5個因素對綜合評分的影響A>B>E>C>D;從綜合評分的極差可以看出,吐溫-80由于用量小,對膜的性能影響不大。

從表8可見,PVA-124的用量對涂膜劑成膜性能的影響有顯著性差異,而白及膠漿、甘油、吐溫-80和可溶性淀粉的用量對涂膜劑成膜性能的影響沒有顯著性差異。根據直觀分析表和方差分析表的結果得出,霧水葛涂膜劑最佳工藝處方是A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及膠漿4g、甘油1.5g和吐溫-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉。

按照正交試驗結果優化配比A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及膠漿4g、甘油1.5g和吐溫-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉,制成三批涂膜劑,進行成膜時間、外觀質量和綜合評分的測定,結果如表9。

表9 制備工藝的驗證實驗

結果顯示平均成膜時間4.3min,外觀質量8.8分,綜合評分14.5分,這說明制備后的處方工藝可靠,重復性較好。

2.3 水葛涂膜劑的抑菌考察結果

結果如下表10。

表10 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑對三種細菌的抑菌圈

50mg/mL和100mg/mL總黃酮濃度的霧水葛涂膜劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌圈直徑與陽性對照組對比P≤0.05且P≤0.01,說明50mg/mL和100mg/mL總黃酮濃度的霧水葛涂膜劑對三種菌的抑菌圈直徑與陽性對照組均有極顯著性差異。

2.4 霧水葛涂膜劑的抗氧化考察結果

結果如下表11和表12。

表11 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc對DPPH自由基的清除率

表12 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc的還原能力

通過預實驗,見圖1,得出霧水葛總黃酮涂膜劑對DPPH自由基的清除率的總黃酮濃度合適范圍是0.05～0.8mg/mL。在總黃酮濃度0.05～0.8mg/mL內,霧水葛涂膜劑和Vc對DPPH自由基清除率均呈現逐漸上升的趨勢并最終達到了穩定值。在總黃酮濃度0.05～0.2mg/mL內,霧水葛涂膜劑對DPPH自由基的清除率低于Vc組;總黃酮濃度0.2～0.8mg/mL內,霧水葛涂膜劑對DPPH自由基的清除率高于Vc組。霧水葛涂膜劑的DPPH自由基清除率最高值超過了Vc組,說明霧水葛涂膜劑有良好的清除DPPH自由基的能力。在實驗濃度范圍內,見圖2,隨著總黃酮濃度的增加,霧水葛涂膜劑和Vc的清除率值均呈現上升趨的勢,且霧水葛涂膜劑的清除率值均大于Vc組。這說明霧水葛涂膜劑有良好的還原能力。

圖1 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc對DPPH自由基的清除率

圖2 不同總黃酮濃度霧水葛涂膜劑和Vc的還原能力

3 討論

霧水葛在民間有廣泛的應用,大量的文獻證明霧水葛有良好的抗炎鎮痛作用,可消腫祛膿、清熱解毒、利水通淋,主要用于急性乳腺炎以及各種化膿性皮膚感染的治療。本實驗通過以霧水葛總黃酮為原料制備的涂膜劑,進行對化膿性感染常見的綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實驗,初步探討其抑菌的活性成分。實驗結果表明,霧水葛總黃酮涂膜劑對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的有一定抑菌效果,具有一定的抗炎祛痘功效。涂膜劑使用方便,毋須進行包扎,容易進行清洗,制備工藝也較為簡單,適合對大眾的普及,未來應加強對其質量標準的研究。