貴州地方雞種主要疫病流行情況監測

韓 雪，徐 丹，徐景峨，苗小猛，伍革民，馮宇隆，伍友豪，舒 剛，趙小玲

（1.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005；2.貴州宏宇畜牧技術發展有限公司，貴州貴陽 550005；3.四川農業大學，四川成都 611130）

2021 年新一輪全國畜禽遺傳改良計劃針對地方特色品種雞生產性能低、生物安全體系不健全、疫病凈化不到位等問題提出了一系列的要求及目標，強調了加強對地方雞種種源垂直傳播疫病的凈化，重點凈化以雞白痢沙門氏菌病、禽白血病等為主的種源垂直傳播疫病。在當前國家政策的要求下，應加強家禽疫病綜合防控工作，著力解決我國家禽養殖業疫病防控的短板[1]。

貴州地處中國西南部，地勢復雜，具有高原、山地、丘陵和盆地等4 種地形，其中92.5%的面積為山地和丘陵。其多樣的地形地貌和豐富的林地資源，以及多民族的人文背景，造就了極為豐富的家禽資源，擁有畢節地區烏蒙烏骨雞和威寧雞、安順地區高腳雞、黔西南地區興義矮腳雞、黔東南地區小香雞、遵義地區赤水烏骨雞、長順綠殼蛋雞、黔南地區瑤山雞等8 個國家畜禽遺傳資源品種。這些品種具有豐富多樣的體型外貌特征、優良的肌肉品質和突出的抗病和抗逆能力，是保障人民群眾日益豐富的物質文化需求的重要基因庫[2]。近年來，隨著貴州生態家禽產業不斷發展壯大，優質地方雞的開發利用也越來越受重視。但是，隨著養殖規模的壯大、集約化水平低、養殖環境差等因素造成各種疫病頻發，嚴重危害了貴州地方養禽業的發展[3]。

為了保障貴州地方優質雞種產業的大力發展，減少疫病對養殖業的沖擊，本文首次系統的對貴州8 個地方雞種的各類主要疫病流行情況進行了調查，以期為貴州地方雞養殖中雞白痢、大腸桿菌病、禽流感、新城疫、禽白血病等常見疫病的防控及凈化工作提供流行病學依據，為貴州地方雞種常見疫病預防提供數據支撐，促進健康養殖，提高經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本采集

2021 年，本研究從貴州烏蒙烏骨雞、威寧雞、普定高腳雞、興義矮腳雞、黔東南小香雞、赤水烏骨雞、長順綠殼蛋雞和瑤山雞等8 個地方雞種雞場（戶）采集了用于禽流感和新城疫抗體滴度測定的240 份雞翅靜脈血清樣品，用于禽白血病-J 亞群的酶聯免疫吸附試驗檢測的240 份泄殖腔棉拭子，以及用于沙門氏菌和大腸桿菌分離的240 份泄殖腔棉拭子。各個群體隨機抽取30只雞（公母各半）進行大體解剖，臨床鑒別判斷禽流感、新城疫及腫瘤病變。收集腫瘤樣本進行組織病理學診斷，解剖過程中僅在烏蒙烏骨雞中發現一例腫瘤病變。樣本信息見表1。

1.2 主要試劑及儀器

禽白血病-J 亞群抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司；1%公雞紅細胞懸液（自配），禽流感抗原和陽性血清由哈爾濱國生生物科技股份有限公司提供，新城疫抗原和陽性血清由中國獸醫藥品監察所提供。LB 肉湯、SC 肉湯培養基、MH 肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基、SS 瓊脂培養基、亞硫酸鉍培養基等均購于杭州天和微生物試劑有限公司。8 種藥敏紙片（多西環素、妥布霉素、阿奇霉素、氨芐西林、紅霉素、慶大霉素、諾氟沙星、新霉素）購自成都市科龍化工試劑廠。

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS，上海申安醫療器械廠），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（江蘇蘇靜集團泰安有限公司），恒溫培養箱（北京中興偉業儀器有限公司），數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），氣浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司），電熱鼓風干燥箱（101-4，上海實驗儀器廠有限公司），電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司），旋渦混合器（XW-80A，上海青浦滬西儀器廠），徠卡顯微成像系統（DM1000，德國Leica），石蠟切片機（RM2235，德國Leica）。

1.3 試驗方法

1.3.1 禽白血病及新城疫、禽流感抗體水平測定

按照禽白血病-J 亞群的ELISA 抗體檢測試劑盒說明書進行抗體檢測和結果判定。新城疫抗體檢測參照《新城疫診斷技術》（GB/T16550—2020），采用血凝（HA）血凝抑制試驗（HI）方法進行，HI 抗體≥4log2 的樣品判定為合格。禽流感H5 亞型H5（Re-6）、H5（Re-8）、H9 亞型禽流感抗體檢測參照《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936—2020），采用血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）方法進行，HI 抗體≥5log2的樣品判定為合格[4]。

1.3.2 大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測

（1）細菌分離純化

無菌采集泄殖腔棉拭子樣本，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基，37℃恒溫培養12～24h，在麥康凱培養基上生長出表面光滑濕潤、邊緣整齊稍凸起，直徑1～2mm 的紅色圓形菌落，接種到SS培養基37℃培養12～24h，生長出粉紅菌落，在亞硫酸鉍瓊脂表現不生長，革蘭氏染色陰性小桿菌，則判定為大腸桿菌；在麥康凱培養基上生長出淡黃色半透明單個菌落，接種到SS 培養基37℃培養12～24h，生長出無色至灰白色，半透明或不透明，菌落中心有時呈黑色的菌落，在亞硫酸鉍瓊脂生長為綠色單個菌落，革蘭氏染色陰性小桿菌，則判定為沙門氏菌。重復上述純化步驟2 次[5]。

（2）藥敏試驗

采用平板計數法將菌液濃度調至1.0×106CFU/mL，將調制后菌液200μL 均勻涂抹于普通瓊脂培養基，取8 種抗生素藥敏紙片（慶大霉素、妥布霉素、新霉素、阿奇霉素、多西環素、紅霉素、諾氟沙星、氨芐西林），平整貼在培養基上，37℃培養24h 后，測定細菌抑菌圈大小。藥敏試驗采用Kirby-bauer 瓊脂擴散法[6]，依照藥敏紙片的抑菌效果范圍標準判定藥物敏感程度（表2）。

表2 藥物敏感性標準

1.3.3 腫瘤組織病理學診斷

將4%多聚甲醛固定的組織樣本，經流水沖洗30min，進行組織修塊，放入病理包埋塑料筐中進行脫水（75%乙醇6h，85%乙醇10h，95%乙醇4h，無水乙醇Ⅰ2h，無水乙醇Ⅱ2h），透明（二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min），浸蠟3h，包埋組織塊于石蠟中。隨后采用Leica RM2235切片機將組織切成5μm 厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60℃烘烤切片至少2h。之后，切片經二甲苯脫蠟后，流水洗滌20min，用蘇木素染色30min，流水洗滌20min，鹽酸酒精分化，伊紅染色5min，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹脂膠封片。在顯微鏡下觀察腫瘤的病理變化，完整地瀏覽整張組織片，對各組明顯病變的部位均采用顯微成像系統拍照記錄。

1.4 數據分析

將檢測結果錄入Excel，按區域和場點類別對檢測結果進行統計和描述，分析得出不同地區、不同品種雞群疫病流行情況。

2 結果

2.1 血清抗體檢測結果

8 個貴州地方品種雞群的血清禽白血病抗體檢測結果如表3 所示，禽白血病平均抗體陽性率為38.75%。不同品種雞群中禽白血病抗體的陽性率存在一定差異：興義矮腳雞最低（10%），赤水烏骨雞最高（76.66%）；威寧雞、烏蒙烏骨雞和赤水烏骨雞三個品種雞群禽白血病陽性率超過50%。貴州黔南自治區、貴州黔東南自治區、貴州省畢節市、貴州黔西南自治區和貴州省遵義市5 個區域的禽白血病陽性率結果對比顯示，貴州黔西南自治區最低（10%），貴州省遵義市最高（76.66%），貴州省畢節市禽白血病陽性率也超過50%。此外，從樣本來源角度分析，保種場來源的雞群禽白血病陽性率為46.11%，而保護區農戶來源的雞群禽白血病陽性率為16.67%。

表3 貴州省各地方品種雞雞群禽白血病抗體檢測結果

8 個貴州地方品種雞群的血清新城疫和禽流感抗體檢測結果如表4 所示，所有品種新城疫抗體效價均高于4log2，符合免疫要求。威寧雞和赤水烏骨雞禽流感病毒H9 亞型抗體效價低于5，需要補充疫苗接種；興義矮腳雞和普定高腳雞禽流感病毒H5N8 亞型抗體效價為0，可能沒有注射該血清型疫苗，需要補充疫苗接種；興義矮腳雞、黔東南小香雞和普定高腳雞禽流感病毒H5N6 亞型抗體效價低于5，需要補充疫苗接種。此外，臨床解剖診斷未發現禽流感和新城疫感染病例，所有泄殖腔棉拭子樣本均未檢出禽流感病毒和新城疫病毒特異性核酸，8 個地方品種雞群無禽流感和新城疫感染。

表4 貴州省各地方品種雞雞群新城疫和禽流感抗體檢測結果 單位：nlog2 個滴度

2.2 大腸桿菌和沙門氏菌的分離及耐藥性檢測結果

細菌分離結果如表5 所示，從長順綠殼蛋雞、興義矮腳雞、黔東南小香雞、普定高腳雞、赤水烏骨雞和瑤山雞泄殖腔棉拭子中分離出大腸桿菌菌株；從普定高腳雞和赤水烏骨雞泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株。威寧雞與烏蒙烏骨雞未分離出大腸桿菌及沙門氏菌菌株。

表5 貴州各地方品種雞肛門拭子細菌分離情況

所分離出的大腸桿菌和沙門氏菌藥敏結果如表6 所示，結果顯示來自貴州省6 個地方品種雞泄殖腔棉拭子所分離的大腸桿菌和沙門氏菌均存在不同程度的耐藥問題。其中從長順綠殼蛋雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、多西環素、諾氟沙星和阿奇霉素敏感，對妥布霉素、紅霉素和氨芐西林耐藥；從黔東南小香雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、多西環素、紅霉素、和諾氟沙星敏感，對妥布霉素和氨芐西林耐藥。從興義矮腳雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素和妥布霉素敏感，對紅霉素、多西霉素和氨芐西林耐藥；從普定高腳雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、妥布霉素和新霉素敏感，對多西霉素、紅霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥；從瑤山雞分離出的大腸桿菌菌株僅對慶大霉素敏感，對多西環素、妥布霉素、紅霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥；從赤水烏骨雞分離出的大腸桿菌菌株僅對諾氟沙星敏感，對慶大霉素、多西環素、妥布霉素、新霉素、紅霉素和氨芐西林耐藥。對于所分離出的沙門氏菌菌株，從赤水烏骨雞中分離的菌株對多西環素、妥布霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥，對慶大霉素敏感；從普定高腳雞所分離出的菌株僅對紅霉素和氨芐西林耐藥，對慶大霉素、多西環素、妥布霉素、新霉素和諾氟沙星敏感。

表6 抑菌圈直徑 單位：mm

2.3 腫瘤病理檢測結果

在烏蒙烏骨雞中這例腫瘤樣本病理診斷結果為肝臟組織膽管癌。組織病理學顯示肝內膽管系統上皮惡性細胞增生。瘤細胞呈立方形，泡狀核，胞質中的嗜堿性顆粒較少，排列以管狀結構為主。大量增生的膽管上皮細胞為立方柱狀上皮細胞，呈腺體樣復合排列，有或無管腔，通過組織細胞隔彼此分離，與腫瘤增殖相關的異嗜性粒細胞浸潤明顯（圖1）。

圖1 烏蒙烏骨雞雞肝臟膽管瘤病理切片圖

3 討論

從監測結果來看，貴州地方品種雞有不同程度禽白血病感染情況，應加強對禽白血病的防控，特別是貴州省畢節市畢節地區威寧雞和烏蒙烏骨雞以及貴州省遵義市赤水烏骨雞存在嚴重感染。該病尚無疫苗和特效藥，有效的防控方法是以“檢測-淘汰陽性雞”為主的凈化措施。張小波等人在2019 年對貴州地方品種雞禽白血病流行病學調查的研究中同樣提示畢節地區威寧雞和烏蒙烏骨雞存在禽白血病嚴重感染的現象[7]。此外，本試驗采用泄殖腔棉拭子ELISA 檢測，而雞基因組中內源性的禽白血病-E 亞群cDNA 在一定條件下會表達出完整的禽白血病，因此可能出現禽白血病陽性率檢測偏高的現象[8]。禽白血病多以隱性感染形式存在于臨床健康雞群中，當雞群因各種應激因素導致抵抗力降低時，這些病毒就會大量復制，從而引起雞群發病和死亡，并可垂直傳播給下一代，導致上述病原難以根除。外來品種帶入、自然感染和部分禽用疫苗制品質量不達標，可能是導致這些病原在雞群中廣泛存在的重要原因[9]。因此，貴州地方品種雞群對禽白血病的防控不僅應該注意雞群之間的傳播，也應該對地區之間禽類交易及運輸做好相關的措施。此外，本試驗在8 個貴州地方雞群中均未檢出禽流感和新城疫感染病例，提示雞場對這兩種疾病的防控工作效果較好。新城疫抗體水平較為理想，基礎免疫程序合理，疫苗免疫效果良好，為雞群提供了較好的保護力。禽流感是一種嚴重危害家禽產業發展的烈性傳染病[10]，貴州8 個地方雞種禽流感抗體水平不整齊，特別是農戶散養土雞興義矮腳雞和普定高腳雞，這兩個雞群禽流感各血清型的抗體效價不夠高或者離散度大，抗體滴度差距大，建議定期開展免疫抗體監測，同時增加免疫程序管理，提高雞群免疫抗體保護力。

沙門氏菌和大腸桿菌均是條件性致病菌，當動物機體抵抗力下降時，細菌與宿主的生態平衡被打破，細菌的致病性便會表現出來，嚴重危害機體健康[11,12]。大腸桿菌與沙門氏菌既可單獨感染雞群，也可與其他病原菌混合感染致發病，實際生產中大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例尤為突出，在我國養雞行業廣泛存在，其危害貫穿整個養殖周期，導致經濟效益下降等一系列問題[5]。因此，對沙門氏菌的流行和感染狀態進行監測具有十分重要的意義。本試驗檢測結果提示威寧雞與烏蒙烏骨雞日常衛生管理水平良好，清欄、消毒等措施較佳，未檢出大腸桿菌和沙門氏菌；其他6 個貴州地方品種泄殖腔棉拭子中均分離出大腸桿菌菌株，且普定高腳雞和赤水烏骨雞的泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株，提示有沙門氏菌和大腸桿菌感染的風險。因此，建議相關養殖場（戶）加強日常管理，提高生物安全意識，嚴格落實各項消毒制度，從而降低大腸桿菌病和雞白痢的發生及危害。

大腸桿菌和沙門氏菌都易產生對抗生素的耐受性，而且多重耐藥現象嚴重，尤其是大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例[13]。混合感染時，雞的死亡率較高，用藥難度較大，其發病率、死亡率顯著增高。兩種細菌血清型種類較多，不同地區差別較大，不同菌株之間不產生交叉保護作用，極易產生耐藥性[14]。本試驗結果表明，來自貴州省6 個地方品種雞泄殖腔棉拭子所分離的大腸桿菌和沙門氏菌均存在不同程度的耐藥問題，提示這些雞場可能存在抗生素濫用的情況，因此建議這些雞場若發生此類型病情時應根據藥敏試驗結果指導科學用藥，且應注意交替用藥，或選用中藥抗菌制劑，以獲得良好的治療效果。根據大腸桿菌與沙門氏菌的流行特點，要有效控制和預防疾病的發生，首先應該加雞場強飼養管理水平，改善環境衛生條件，同時提高雞群免疫力和雞場生物安全管理能力，從而有效抵御病原的侵襲，減少重大疫病發生風險。

本次試驗發現，8 個貴州地方品種雞群隨機大體剖檢結果，僅僅發現一列腫瘤病變，彰顯了貴州地方雞種獨特的環境適應性、抗寒、抗潮濕、抗病性[2]。與本試驗監測結果一致，前人研究發現貴州地方雞常見疾病為病毒或細菌引起的傳染病[15]。回溯貴州8 個地方種雞群采樣場群發現，不同養殖環境、不同種雞品種及其來源地區等與病毒或細菌性疾病的發生情況密切相關。因此，在開展貴州地方品種雞保種選育及開發利用過程中，針對不同地區和不同品種，加強持續不斷地監測，及時淘汰患病陽性雞；改善飼養條件，重視雞舍建筑；加強飼養管理和消毒殺菌技術，制定合理的免疫防控措施；逐步實現對貴州地方雞群傳染性疾病的凈化。

4 結論

8 個貴州省地方雞種白血病陽性率為10%～76.66%；新城疫抗體水平較為理想，但禽流感抗體水平不整齊，未檢出禽流感和新城疫感染病例；除威寧雞和烏蒙烏骨雞外，其他6 個貴州地方品種泄殖腔棉拭子中均分離出大腸桿菌菌株，普定高腳雞和赤水烏骨雞的泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株，且均存在不同程度的耐藥。通過掌握貴州地方雞的常見疾病，做好相對應的防治措施，可有效提升貴州地方雞的生產性能和養殖效益，有利于開展和推進貴州地方雞的品種保護工作，提升貴州地方雞的價值。