四川爐霍縣牦牛源蜱種類的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

洛絨鄧珠，藍(lán) 嵐，向 陽，潘 瑤，郝力力

（1.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省鹽亭縣高端人才服務(wù)中心，四川 鹽亭 621600）

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2021年3月～2021年8月，分別在爐霍縣雅德鄉(xiāng)、斯木鄉(xiāng)、仁達(dá)鄉(xiāng)、旦都鄉(xiāng)、泥巴鄉(xiāng)和宜木鄉(xiāng)6個(gè)鄉(xiāng)的416頭牦牛體表采集蜱。在各鄉(xiāng)選3～4個(gè)村，各村選2～4個(gè)農(nóng)場(chǎng)，從每頭牦牛的體表采集5～6 只蜱。按照地點(diǎn)編號(hào)分別裝入采集管中，塞入潮濕脫脂棉，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后將蜱浸于75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：組織基因組DNA提 取 試 劑 盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、Trans 2K DNA Marker、1×TAE 溶液和瓊脂糖購自北京全式金公司，1.1×T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物有限公司；引物合成與測(cè)序均由生工生物工程（成都）有限公司完成。儀器：德國徠卡體式顯微鏡（Leica S9D），多功能生物樣品均質(zhì)器（Bertin Precelly 24），賽默飛微量離心機(jī)（Pico 17），德國耶拿Biometra TRIO 三槽PCR 儀（Biometra TRIO 48），北京六一儀器廠電泳儀（DYY-6C），全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon 5200 Multi）。

1.3 蜱形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》［1］，在體視顯微鏡下觀察蜱形態(tài)特征并拍照保存。

1.4 DNA提取 取出保存在75%乙醇溶液中的蜱，用無菌去離子水沖洗3 次。待干燥后沿蜱縱向中軸線切為兩半，分別裝入兩支1.5 mL EP 管中，一支置于－80 ℃冰箱凍存，一支加入500 μL無菌水用多功能生物樣品均質(zhì)器充分研磨。研磨程序如下：每管加入陶瓷珠（直徑0.5 mm 的20 珠和2 mm 的5 珠），5 500 g 研磨2 次，4 000 g 研磨1 次。取 研 磨 液200 μL，根 據(jù)EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒說明書提取蜱基因組DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 檢測(cè) 參照Abdullah 等［2］報(bào)道的方法對(duì)蜱進(jìn)行分子鑒定，引物信息見表1。PCR 擴(kuò)增體系如下：模板1 μL，上游、下游引物各1 μL（10 μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，充分混勻。設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照（去離子水）。蜱ITS2基因的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。

表1 PCR引物

1.6 序列分析及統(tǒng)計(jì)分析 將全部陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，使用DNAStar 軟件對(duì)所得全部序列進(jìn)行拼接分析，在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST比對(duì)，再使用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值為1 000）構(gòu)建分子進(jìn)化樹，并用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 樣本采集數(shù)量及形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)初步鑒定，在爐霍縣的6 個(gè)采集點(diǎn)共鑒定出2 種蜱，即微小扇頭蜱與青海血蜱。其中，微小扇頭蜱791只，占96.5%，為優(yōu)勢(shì)種；青海血蜱29只，占3.5%。在仁達(dá)鄉(xiāng)、斯木鄉(xiāng)、宜木鄉(xiāng)、泥巴鄉(xiāng)這4 個(gè)采集點(diǎn)只采集到微小扇頭蜱；在旦都鄉(xiāng)和雅德鄉(xiāng)則采集到這兩種蜱。結(jié)果詳見表2。

2.2 蜱的分子鑒定

2.2.1 蜱ITS2 基因擴(kuò)增 以1.4 中提取的DNA為模板，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增蜱的ITS2基因片段，結(jié)果顯示在1 600 bp左右處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 蜱ITS2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果（部分樣本）

2.2.2ITS2 基因遺傳進(jìn)化分析 將測(cè)序所得的全部序列進(jìn)行拼接、比對(duì)后共得到19條不同的序列，其中5 條為青海血蜱（H.qinghaiensisLuhuo 1-4），其余14 條為微小扇頭蜱（R.microplusLuhuo 1-14）。選取經(jīng)BLAST比對(duì)后同源性最高的1～2條序列確定種，顯示為青海血蜱及微小扇頭蜱；在NCBI 中選取分離自不同地區(qū)的青海血蜱和微小扇頭蜱的ITS2基因序列，選取其他幾個(gè)種的血蜱和革蜱的ITS2基因序列作為參考序列，構(gòu)建分子進(jìn)化樹（如圖2和圖3所示）。本研究所得的5 條青海血蜱序列均與甘肅平?jīng)觯↗Q737119）、青海省（JQ737115）H.qinghaiensis的親緣關(guān)系最近，并聚于一大支，相似性在97.4%～97.6%。

圖2 ITS2基因構(gòu)建青海血蜱進(jìn)化樹

圖3 ITS2基因構(gòu)建微小扇頭蜱進(jìn)化樹

R.microplusLuhuo1-14 的相似性在97.6%以上，其差異在0.1%～2.3%。進(jìn)化分析顯示14 條序列均與微小扇頭蜱的親緣關(guān)系最近，聚于一支，相似性在99.2%～100%。其中，R.microplusLuhuo2 與貴州（JQ737125）分離到的微小扇頭蜱的親緣性最高，為100%；R.microplusLuhuo12 與湖南湘西（MK224585）分離到的微小扇頭蜱的同源性最低，為99.2%。

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定要求鑒定人員的專業(yè)能力較強(qiáng)、工作經(jīng)驗(yàn)豐富，如蜱存在肢體不完整或外形極為相似的情況，則較難鑒定［3-4］。在寄生蟲的分子鑒定方法中，當(dāng)前最為常用的是RCR 和DNA 測(cè)序。自2003 年Hebert 等提出DNA 分類學(xué)可用于物種鑒定以來，DNA 條形碼技術(shù)得到了迅速發(fā)展，目前已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲的鑒定［5-6］。

本研究僅鑒定出2 種蜱，即微小扇頭蜱和青海血蜱，這可能與本次收集蜱的方法、宿主及收集蜱的地理位置有關(guān)。本研究中微小扇頭蜱的占比高達(dá)96.5%，為爐霍縣半農(nóng)牧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種，可能是體表采集這種方式及微小扇頭蜱本身的生活史導(dǎo)致的，因?yàn)樗堑湫偷囊凰拗黩纾紫x、若蟲、成蟲各階段均在一個(gè)宿主上生長發(fā)育，只有飽血后的成蟲才會(huì)離開宿主，并且它的主要生活環(huán)境也是以農(nóng)區(qū)為主。6個(gè)采樣點(diǎn)均屬于半農(nóng)牧地區(qū)，地理位置均分布在鮮水河沿線兩岸，故農(nóng)牧民的放牧區(qū)域主要集中于沿河流域的草地、農(nóng)區(qū)等，此類地區(qū)均為蜱類適宜生存的地區(qū)。本研究中青海血蜱的占比較少，僅為3.5%，僅在雅德鄉(xiāng)、旦都鄉(xiāng)有檢出，這可能和采集方法、宿主有關(guān)系，因其為三宿主蜱，在幼蟲階段、若蟲階段、成蟲階段吸飽血后都會(huì)脫落，其生活史中九成時(shí)間都屬于非寄生階段。非寄生階段的蜱棲息于草原、森林等環(huán)境中。

本研究樣本僅在牦牛的體表采集，今后可以采用其他方法如布旗法，或者擴(kuò)展被采集樣本的宿主種類，如犏牛、藏綿羊等，以進(jìn)一步了解爐霍縣分布的蜱種類。另外，不同種類的蜱賴以生存的環(huán)境條件有所差異，如海拔高度、季節(jié)時(shí)間、植被類型等。爐霍縣境內(nèi)平均海拔有3 860 m，而青海血蜱恰是在高山地區(qū)分布的高原特有種。

4 結(jié)論

截至目前，共檢測(cè)出2 種蜱，證明爐霍縣至少存在微小扇頭蜱和青海血蜱。共采集到成蜱820 只，其中青海血蜱29 只，占3.5%；微小扇頭蜱791只，占96.5%，為優(yōu)勢(shì)種。微小扇頭蜱為爐霍半農(nóng)牧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種，在采樣的6 個(gè)半農(nóng)牧鄉(xiāng)均有分布。青海血蜱僅存在于雅德鄉(xiāng)和旦都鄉(xiāng)。