BTLA、CTLA-4 基因多態性與肝癌TACE 聯合靶向治療療效及預后相關性

陸小華，袁洪新

（南通大學附屬醫院介入放射科，江蘇 南通，226001）

肝癌目前在我國是第四大惡性腫瘤，其致死率位居第二，僅次于肺癌，肝癌早期隱匿，疾病進展較快，絕大多數患者確診時已經處于中晚期或伴有嚴重肝硬化，此時已經失去最佳手術治療時機，而介入治療是其有效替代最佳治療方案[1-2]。經動脈插管化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是目前治療中晚期肝癌患者常用手段，可有效殺傷腫瘤病灶，改善機體免疫功能、生活質量[3]。臨床評價TACE 療效和預后主要依靠影像學數段，從腫瘤數目、大小等表觀學方面進行評價[4]，但從微觀基因方面評價療效和預后的研究少見。人類基因組計劃研究顯示，不同個體間相同基因組序列同源度達99%以上，其余約1%為遺傳變異，多見于單堿基改變，即單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）[5]。最近研究發現，B 及T 淋巴細胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）、細胞毒性T 淋巴細胞抗原-4（cytotoxicT-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等基因多態性與多種腫瘤易感性密切相關，其基因位點突變可增加腫瘤發生[6-7]。基于以上背景，本研究創新性觀察BTLA、CTLA-4基因多態性與肝癌TACE 聯合靶向治療療效及預后相關性。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

選取2021 年1 月至2021 年12 月南通大學附屬醫院介入放射科收治的新發85 例肝癌患者作為研究對象，其中男65 例，女20 例；年齡36～65 歲，平均（52.35±5.34）歲；Child-Pugh 分級：75 例A 級，10 例B 級；BCLC 分期：20 例B 期，65 例C 期。納入標準：符合《原發性肝癌診療規范（2019 年版）》[8]診斷標準，經病理學檢查確診；均行TACE 聯合靶向治療；美國東部腫瘤協作組體能狀態評分均為0～1 分；Child-Pugh 分級為A 級、B 級；BCLC 分期為B 期、C 期；TACE 前白細胞≥4.0×109/L、血紅蛋白≥8.0 g/L；無全身性感染疾病；近3 個月無免疫抑制、激素藥物治療史。排除標準：大量腹水經治療后不能消除；近3 個月出現消化道出血；既往存在肝移植、放化療或系統性等治療；嚴重脾功能亢進；其他惡性腫瘤；預計生存期 ＜ 6 個月；免疫系統疾病；妊娠期或哺乳期女性。本研究獲得南通大學附屬醫院醫學倫理委員會批準（批號：2020-K024-01）。

1.2 治療方法

所有受試者均在Innova IGS540 DSA 血管造影X 射線機（美國GE 公司）行TACE 治療。操作步驟：常規碘伏消毒、1%利多卡因局部麻醉，采用Seldinger 改良法經右側股動脈穿刺置鞘，置入5F RH 導管至腹腔干、腸系膜上動脈，行碘克沙醇造影，確定腫瘤供血動脈。用Progreat 微導管或Merit 微導管超選進入肝臟腫瘤動脈供血分支中，灌注表柔比星0～30 mg、洛鉑20～30 mg化療藥物，予表柔比星10 mg 與碘化油混制乳劑10～25 mL 栓塞，至腫瘤內碘油沉積致密后終止栓塞。最后再次造影，顯示腫瘤供血動脈分支栓塞滿意后結束手術。所有入組患者均在TACE 治療后3～7 d 開始口服索拉非尼（400 mg bid）或侖伐替尼（＜ 60 kg 患者，8 mg，qd；≥60 kg 患者，12 mg，qd），如患者出現藥物相關嚴重不良事件則適當減少劑量或停藥觀察。

療效評估：治療1 個月后，根據RECIST 實體瘤療效評價標準進行療效評估[9]，完全緩解：腫瘤病灶完全消失，部分緩解：病灶直徑減小≥50%，穩定：病灶直徑減小 ＜ 50%，進展：病灶直徑增加 ＞ 25%或出現新病灶。有效組：完全緩解、部分緩解、穩定；疾病進展組：進展。

1.3 BTLA、CTLA-4 基因多態性檢測

采集2 組患者靜脈血3 mL，經抗凝處理后，按照DNA 抽提試劑盒（上海生工公司）提取患者DNA，并對其進行檢測定量。獲取CTLA-4 基因rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點、BTLA 基因 rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位點，設計并合成SNP 位點擴增引物，PCR 體系如下：2 μL DNA 模板（10 ng/μL），上下游引物各1 μL，15 μL 2×PCR Ready Mix，在PCR 儀進行擴增，程序為：94℃預變性4 min、94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35 次循環，72℃終延伸10 min，4℃保存。反應結束后，采用1%瓊脂糖膠電泳檢測PCR 產物，確定產物大小，用AMPure XP 磁珠純化、回收。最后使用HiSeq XTen 測序儀進行測序。采用panel 高通量數據分析基因分型。

1.4 觀察指標

（1）比較2 組臨床資料，包括性別、腫瘤最大徑、年齡、腫瘤數目、BMI、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、肝外轉移、血管侵犯；（2）分析BTLA、CTLA-4 基因多態性檢測結果，CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859 629T 位點均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律；（3）比較2 組BTLA、CTLA-4 基因位點基因型；（4）單因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多態性與療效的相關性；（5）比較不同BTLA、CTLA-4 基因位點基因型患者生存預后狀況；（6）單因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多態性與生存預后的相關性。

1.5 統計學處理

臨床病歷資料收集使用EXCEL 2019，數據處理使用軟件SPSS 25.0，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗，等級資料用Ridit檢驗；計量資料呈方差齊性、近似服從呈正態分布以（）表示，采用t檢驗；采用K-M 法繪制生存曲線，單因素、Logistic 多因素回歸分析BTLA、CTLA-4 基因多態性與療效、預后相關性。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組臨床資料

2 組年齡、性別、BMI 差異無統計學意義（P＞0.05）；腫瘤最大徑、腫瘤數目、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、肝外轉移、血管侵犯差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 2 組臨床資料比較[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

表1 2 組臨床資料比較[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

*P ＜ 0.05。

2.2 BTLA、CTLA-4 基因多態性檢測結果

經 TaqMan qRT-PCR 檢測顯示，BTLA rs2171513 位點基因型為GG、GA、AA；rs3112270位點基因型為AA、AG、GG；rs1982809 位點基因型為GG、GA、AA；rs16859629T 位點基因型為TT、TC、CC；CTLA-4 rs231775 位點基因型為GG、GA、AA；rs733618 位點基因型為CC、CT、TT；rs3087243 位點基因型為GG、GA、AA；rs4553808 位點基因型為AA、AG、GG。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，隨機選取10%樣本進行基因測序驗證，使用SeqMan 軟件查看測序結果，證實上述位點存在基因多態性。

本研究85 例患者CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點基因型分布情況，見表2。經符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗，具有人群代表性。

2.3 2 組BTLA、CTLA-4 基因型分布情況

2 組 BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位點基因型分布情況差異無統計學意義（P＞ 0.05）；治療有效組BTLA rs3112270 位點AG、GG 基因型比例、rs1982809 位點GA、AA比例、rs16859629 位點CC 基因型、CTLA-4 rs231775 位點AA 基因型比例、rs3087243 位點GA、AA 基因型低于疾病進展組，BTLA rs3112270位點AA 基因型比例、rs1982809 位點GG 比例、rs16859629 位點TT 基因型、CTLA-4 rs231775 位點GG 基因型比例、rs3087243 位點GG 基因型高于疾病進展組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表3。

2.4 BTLA、CTLA-4 基因多態性與療效的相關性

在進行Logistic 多因素回歸分析時，將腫瘤最大徑、腫瘤數目、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、肝外轉移、血管侵犯等其他混雜因素進行校正。經單因素、Logistic 多因素回歸分析顯示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 與療效無關（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與療效相關（P＜ 0.05），見表4。

2.5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存預后狀況

85 例患者隨訪18 個月，脫落3 例，生存率為 68.29%（56/82）。KM 曲線分析，BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位點不同基因型患者隨訪18 個月生存率差異無統計學意義（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270 位點AA、AG 基因型患者18 個月生存率高于GG 基因型患者，rs1982809 位點GG、GA 基因型患者18 個月生存率高于AA 基因型患者，rs16859629 位點TT 基因型患者18 個月生存率高于TC、CC 基因型患者（P＜ 0.05）；CTLA-4 rs231775 位點GG、GA 基因型患者18 個月生存率高于AA 基因型患者、rs3087243 位點GG 基因型18 個月生存率高于GA、AA 基因型患者，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表5、圖1～2。

圖1 不同BTLA 位點基因型患者生存曲線Fig.1 Survival curves of patients with different BTLA loci genotypes

圖2 不同CTLA-4 位點基因型患者生存曲線Fig.2 Survival curves of patients with different CTLA-4 genotypes

表5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存預后狀況比較Tab.5 Comparison of survival and prognosis of patients with different BTLA and CTLA-4 genotypes

2.6 BTLA、CTLA-4 基因多態性與生存預后的相關性

在進行Logistic 多因素回歸分析時，將腫瘤最大徑、腫瘤數目、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、肝外轉移、血管侵犯等其他混雜因素進行校正。單因素、Logistic 多因素回歸分析顯示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 與生存預后無關（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與生存預后相關（P＜ 0.05），見表6。

表6 BTLA、CTLA-4 基因多態性與生存預后的相關性Tab.6 Correlation between BTLA and CTLA-4 gene polymorphism and survival prognosis

3 討論

TACE 是治療中晚期肝癌的首選治療手段，與靜脈滴注或口服化療藥物不同，TACE 是利用股動脈插管至肝動脈，將化療藥物送入行局部治療并進行栓塞，可有效提高病灶組織藥物濃度，阻斷腫瘤血供，提高治療率[10-11]。臨床有關TACE 后治療療效和疾病預后評估方法較多，主要采取實驗室指標和影像學等，從宏觀和表觀學方面對其進行評估[12]。

近年研究證實，遺傳易感性可影響肝癌發生發展，迄今為止，研究學者發現在人類基因組中約有一千萬個SNPs，平均每100～300 個堿基對有一個SNPs 位點[13]。大量遺傳學研究發現，一些基因SNPs 與疾病、腫瘤易感性、療效評估、預后有關[14-15]。BTLA 是免疫蛋白超家族成員，也是第3 個被發現免疫抑制受體，主要位于細胞膜表面，定位在3 號染色體3q13 區域，結構與CTLA-4、程序死亡因子-1 的抑制因子類似，主要通過調節T、B 淋巴細胞、DC 細胞、巨噬細胞等表達，在T 淋巴細胞活化階段發揮負性調控作用[16]。正常情況下，BTLA 可與配體結合，進而抑制淋巴細胞過度活化，以防止自身免疫系統損傷；體內免疫功能一旦失衡，BTLA 可通過介導Th1/Th2 細胞平衡、CD8+T 細胞毒性，促進細胞釋放過量炎性因子，進而加重疾病進展[17]。目前有文獻報道，BTLA 基因多態性與腫瘤發生具有明顯關聯性[18]，如Fu 等[19]學者發現，BTLA rs1844089 C ＞ G、rs2705535A ＞ G 位點可增加乳腺癌發生風險。王居巳[20]研究顯示，BTLA rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 基因多態性可增加非小細胞肺癌細胞易感性，但rs2171513 G ＞A、rs3112270 A ＞ G 可降低非小細胞肺癌易感性。本研究通過分析BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位點，發現2 組BTLA rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點基因型比較，差異顯著，進一步分析發現，BTLA rs3112270 A ＞ G、rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 與肝癌療效、預后密切相關。先前有報道顯示，接受鉑類藥物化療可損傷患者DNA，引起堿基序列改變，導致基因對DNA 損傷修復不及時，不能及時修復化療藥物引起的NA 損傷，增加化療藥物耐藥性，影響治療效果[21]。本研究中TACE 聯合靶向治療，化療藥物采用表柔比星、洛鉑，前者為細胞周期非特異性藥物，可迅速進入細胞核與DNA 結合，有效抑制核酸合成和有絲分裂進程，阻止RNA 合成；而后者是第3 代鉑類化療藥物，不僅影響DNA 合成、復制，還可影響原癌基因c-mye 表達。

CTLA-4 是T 淋巴細胞表面較為重要共刺激基因，與CD28 屬同一家族，主要位于染色體2q33 區域，可與CD28 競爭結合B7-1/B7-2 分子，從而發揮負向調節T 淋巴細胞增殖分化作用，還可抑制細胞因子分泌、阻止細胞周期進展[22]。CTLA-4 也是腫瘤免疫檢查點基因，在腫瘤免疫過程中發揮重要作用，目前已有研究顯示，CTLA-4 基因多態性與腫瘤、自身免疫疾病遺傳和環境易感性中存在關聯性，可增加腫瘤、疾病患病風險[23-24]。如Liu 等[25]研究顯示，CTLA-4 rs231775與轉移性腎細胞癌療效、預后密切相關。Qin等[26]通過分析CTLA-4 rs231775、rs3087243、rs4553808、rs5742909、rs733618 位點，發現rs733618 GG 位點與骨髓瘤療效、預后密切相關。本研究顯示，2 組CTLA-4 rs231775、rs3087243位點基因型差異比較，存在明顯差異，單因素和多因素分析顯示，CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與療效、預后相關，這與Qin 等[26]研究結果不一致。分析原因：可能是因為2 種化療方式、化療藥物、CTLA-4 基因位點較多等有關，機體內基因調控機制較為復雜，相同基因位點在不同腫瘤中表現不一。

綜上所述，本研究證實BTLA 基因rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點、CTLA-4 基因rs231775、rs3087243 位點多態性與肝癌TACE 聯合靶向治療療效、預后存在相關性，測定相關基因型可為臨床制定治療方案提供參考依據。因樣本量偏少，不可避免存在選擇偏倚。在今后的研究中我們將擴充樣本量，以期取得更有說服力的結果。