水環境中致病菌快速檢測技術及應用研究進展

鄧 閔，李 露，宋 康*

1.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣東 廣州 511458

2.中國科學院水生生物研究所，淡水生態與生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072

近年來，水環境中的生物污染事件頻發，對人體健康造成了嚴重威脅[1-2].其中，水體致病菌導致的相關疾病是全球范圍內的重大公共衛生問題.為及時反映生物污染的現狀并預測其未來發展趨勢，需要應用高效、準確的致病菌檢測方法[3-5].我國現行的《地表水環境質量標準》(GB 3838-2002)、《城市污水再生利用景觀環境用水水質》(GB/T 18921-2002)和《生活飲用水衛生標準》(GB 5749-2006)僅將糞大腸桿菌群、耐熱大腸菌群和總大腸菌群等指示微生物作為評價水體微生物污染的指標.然而，研究表明環境樣本中主要致病菌的豐度并不總是與指示菌的豐度成正比[6]，傳統的指示菌方法可能無法準確反映天然水體中致病菌的真實污染狀況，需要直接檢測原水中特定的致病菌，控制生物風險[7].

目前我國環保部門常采用多管發酵法檢測水中大腸桿菌(Escherichiacoli)[8]，然而該方法無法區分致病性和非致病性菌株，且無法鑒定大腸桿菌攜帶的毒素基因[9].此外，傳統的細菌培養和生化鑒定等檢測方法操作繁瑣，通常需要48～72 h 才能得到結果，且靈敏度較低，容易產生假陽性和假陰性結果[10].隨著分子生物學技術的不斷發展和進步，利用這些技術快速檢測水體致病菌已成為不可逆轉的趨勢[11].PCR(polymerase chain reaction)是一種通過模擬DNA 的天然復制過程，在體外快速擴增特定DNA 片段的分子生物學技術，在此基礎上，發展出了多重PCR 技術、qPCR(熒光定量PCR)和微流體qPCR 技術(見圖1)[12-19].此外，還包括生物傳感器、微陣列、LAMP(loop mediated isothermal amplification)、數字PCR 和基因編輯在內的分子生物學技術(見圖1).其中生物傳感器作為水體致病菌快速檢測技術，種類眾多，已有國內外綜述進行了系統的報道[20-21]，本文不再論述.本文主要介紹了分子生物學快速檢測方法在環境水體致病菌檢測中的應用現狀，重點關注技術推廣應用時的效率、經濟性以及是否需要專業技術人員等問題，而對于不同技術本身的不足可以參考已有報道[22]；進一步梳理了應用這些檢測方法進行QMRA(quantitative microbial risk assessment)的方法并給出建議.這對在全國或區域范圍內建立高風險致病菌在線監測和自動快速預警系統具有重要參考價值.

圖1 環境水體致病菌檢測技術的發展歷程Fig.1 The developmental trajectory of pathogenic bacteria detection technologies in environmental water bodies

1 致病菌分子生物學快速檢測技術

1.1 熒光定量PCR 技術

qPCR 技術是一種在PCR 反應體系中引入熒光標記的方法，通過特異性引物與目標DNA 結合，利用熒光信號的積累實時監測擴增產物量的變化，并繪制成擴增曲線.該技術具有高特異性、高靈敏度、準確定量以及耗時短的特點(見表1)[9,11,23-24].美國環境保護局已推出了基于qPCR 的腸球菌屬(Enterococcusspp.)標準化快速檢測方法(US EPA method 1609.1)，并被廣泛應用于環境水體致病菌檢測[40].由于引物擴增條件的不同，qPCR 通常一次只能檢測一種致病菌.近年來，有研究通過對引物和探針進行優化，使qPCR反應條件一致，從而實現了對環境水體33 種病原微生物和10 種不同糞便污染標記基因的同時檢測，自動加樣芯片的使用也降低了人員培訓難度[41].

表1 不同致病菌檢測方法及其檢測限Table 1 The detection methods for pathogens and their detection limits

對比qPCR 和傳統膜過濾培養法檢測結果發現它們在時間和空間上都展現出相同的變化趨勢，因此qPCR 適用于環境水體致病菌的定量檢測[24].有研究應用qPCR 調查了秦皇島灤河口海域以及大亞灣海域致病菌豐度的季節性變化，發現大腸桿菌和腸球菌分別是大亞灣海域和灤河口海域的主要致病菌，并探討了致病菌與環境因子之間的相關性[42].qPCR 技術可以有效區分致病毒株和非致病菌株.有研究分別根據痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)侵襲性毒力基因ipaH以及病原性大腸桿菌eaeA、rfbE毒力基因設計了引物，并用于環境水樣中致病菌株的快速檢測[11,43].例如，對北京某地飲用水處理過程中不同階段水樣的檢測表明，水源水約有10%的樣本中有痢疾志賀菌，此外，在水廠消毒后直至用戶使用水的過程中，存在潛在的痢疾志賀菌污染風險[23].qPCR 技術還可以區分活性和非活性的致病菌.PMA(propidium monoazide)可以抑制死亡細胞的DNA 擴增，與qPCR結合可以選擇性地監測水環境中有活性的大腸桿菌[44].此外，由于RNA 在環境中不穩定，也可以被用作判斷活性致病菌存在的分子信標，逆轉錄qPCR 技術可用于環境中活性致病菌的監測[9,45].總體上，qPCR 技術檢出限低，且有優異的特異性和抗干擾能力，但相應的儀器設備價格昂貴，限制了其在水體致病菌檢測中的應用(見表2)[11].

表2 不同致病菌檢測技術優勢與不足Table 2 Advantages and limitations of different pathogen detection technologies

1.2 微陣列技術

微陣列技術，也被稱為DNA 芯片，是通過機械系統將大量DNA 探針固定在硅片等支持物上，在嚴格的條件下與待檢測物質的核酸序列進行互補配對的雜交反應，通過檢測熒光信號或其他標記物來分析反應結果.通過固定特異性的探針，可用于病原微生物血清型、基因型的檢測以及基因表達譜的分析.有研究設計了全部指示性微生物的DNA 芯片，與標準培養法結果進行比較驗證，表明DNA 芯片是檢測水體致病菌的有效工具[46].

微陣列技術檢測通量大(見表2)，可實現對24種常見的環境水體致病菌以及指示性微生物[25]，甚至是地下水中941 種致病菌[47]的同時檢測.然而該技術的檢測限較高，數量級通常在104CFU/樣本水平[25]，利用小亞基rRNA 基因序列進行優化，可以將檢測限降至103genes/樣本[48]，但依然比qPCR 高出2 個數量級(見表1).因此，需要采取一些預處理方法來克服環境水樣中致病菌豐度低的問題.例如，可以通過過濾100 mL 水后將濾膜保留的細菌污染物進行預培養，或者將過濾水體的體積增加10 倍，從而增加主要病原指示微生物的檢出率[46].有研究應用微陣列技術檢測港口航道致病菌，特異性地檢測出了多種弧菌、陰溝腸桿菌(Emterobacter cloacae)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[26](見表1).總體而言，DNA 微陣列的檢測通量極高，然而其靈敏度有待進一步提高.此外，目前微陣列技術的探針設計依賴于有限的經公開驗證的DNA 序列，且其檢測成本較高，限制了其在大規模環境檢測中的應用(見表2).

1.3 微流體qPCR 技術

微流體qPCR(Microfluidic qPCR)技術是一種在微流體芯片中進行qPCR 的技術，它將傳統的qPCR反應體系縮小到微尺度，在微通道中實現高通量的PCR 反應.微流體qPCR 技術具有同時處理多個樣品和多個目標致病菌的能力(見表1).有研究利用20個PCR 反應條件相同的TaqMan 探針開發了可以同時檢測池塘水體樣本中10 種腸道致病菌和1 種糞便指示菌的微流體qPCR 技術[28].為了校正微流體qPCR技術定量過程中由于DNA 不能100%回收所導致的致病菌檢出值偏低的問題，有研究創新性地通過基因工程制造并引入SPC(sample process control strain)至水樣處理過程[49].通過計算不同致病菌和SPC 回收效率比值，從而在測定實際水樣中致病菌時通過加入SPC 進行校正，更加準確地檢測了環境水體中的致病菌豐度[49].此外，微流體qPCR 設備和芯片的制造成本較高，這可能限制了其在偏遠地區的推廣應用.為解決這一問題，有研究構建了非封閉反應池的微流體qPCR 芯片，使得可以方便地手動添加不同引物對，從而降低檢測成本[29].綜合來看，微流體qPCR技術相比傳統qPCR 技術降低了樣本量并增加了檢測通量，其靈敏度也較傳統qPCR 技術更高，但不同研究之間存在較大差異[28-29,49]，且仍需進一步降低使用成本(見表2).

1.4 數字PCR 技術

數字PCR(Digital PCR)技術是一種建立在多個微小反應區域上的PCR 技術，能夠將單個DNA 分子擴增為數百萬個復制物.與傳統的qPCR 技術不同，數字PCR 技術不依賴標準曲線或外部校準品來確定目標DNA 的濃度，而是通過將樣品分成許多微小反應區域，在每個區域中進行擴增，然后通過計算陽性和陰性反應的比例來定量目標DNA 的含量[50].在對海灘娛樂用水和雨水中與污水相關的擬桿菌屬(Bacteroides)HF183 標記基因進行監測時發現，數字PCR 技術和qPCR 技術具有相似的診斷敏感性和特異性[50]；而檢測在飲用水中接種的已知濃度肺炎軍團菌(Legionella pneumophila)時發現，數字PCR 技術相比逆轉錄PCR 技術其精確度更好，重復性更高[51].采用混凝和泡沫分離法將環境水樣濃縮1×104～5×104倍，可以顯著提高數字PCR 技術對環境水體致病菌的檢測靈敏度，檢測耗時可以控制在60 min 以內(見表1)[30].另外，微液滴數字PCR 技術對抑制物具有較高的耐受性，在抑制物濃度比qPCR 技術所能容忍的濃度高出1～2 個數量級時，對定量結果沒有明顯影響[50].總體而言，數字PCR 技術相較于qPCR 技術在靈敏度、精確性和可重復性方面具有優勢，然而，其使用需要更加昂貴的檢測設備、更專業的分析人員以及更高的樣本分析成本(見表2).目前，數字PCR技術在醫院致病菌的檢測方面有所應用，而在偏遠地區和環境樣本大規模檢測方面的應用較為有限.

1.5 多重PCR 技術

多重PCR 技術是一種在同一反應體系中加入多個特異性引物，并通過調節退火溫度來同時檢測多種致病菌或同一致病菌的不同基因型的方法，能夠節省時間和成本，提高檢測效率，適用于大批量樣品在分子水平上進行高通量檢測的需求[52].由于多重PCR技術中使用了多套高度特異的引物，引物設計成為非常關鍵的一步.這些引物應具有相似的退火溫度，以確保多重PCR 技術能夠成功進行.此外，如果多個擴增產物大小接近，結果將很難解讀(見表2).由于這些限制條件，多重PCR 技術一次性分析致病菌的目標基因數遠小于微陣列技術(見表1).近年來，已開發出了水體中多種致病菌的多重PCR 技術[6,31-33].然而，相較于qPCR 技術，多重PCR 技術的檢測時間明顯延長，需要5～12 h.多重PCR 技術的檢測限也比單重qPCR 技術低1～2 個數量級(見表1)[6,31-33].有研究試圖通過增加擴增循環數和熱啟動酶量來提高多重PCR 技術的靈敏度，但結果不理想[31]，這可能是因為在多重PCR 技術中，多個目標序列同時進行擴增，導致競爭，從而降低了擴增效率.盡管如此，在應用多重PCR 技術檢測天然水體中的致病菌時，仍能獲得清晰、穩定、特異且一致的結果[32-33].總體上，未來多重PCR 技術需要考慮開發專門的引物設計軟件和智能算法來輔助引物的選擇和優化，同時改進檢測平臺，提高多重PCR 技術的檢測靈敏度.

1.6 環介導等溫擴增技術

LAMP 技術借助具有高置換活性的bstDNA 聚合酶，采用4～6 條特異性引物，能夠在恒溫條件下快速擴增目標基因[18].該技術不依賴大型設備，可通過肉眼可視的顯色反應、實時濁度儀和熒光信號三種方式對擴增結果進行檢測，操作簡便，因此適用于野外實地檢測.對水體常見致病菌的LAMP 引物和反應條件進行優化后，可在45 min 內完成檢測，最低檢測限為100 copies/樣本[7].傳統基于管式的LAMP 技術檢測過程易受氣溶膠擴散污染的影響，從而可能導致假陽性結果.因此，有研究開發了一種基于分子信標的LAMP 檢測方法，通過引入信標來校正傳統LAMP 檢測方法中可能存在的假陽性結果[34].該方法被用于快速和特異性地檢測副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，豐度檢測限為1 cell/(100 mL)，檢測時限為1 h[34].

LAMP 技術可與微流控芯片技術相結合，具有高度集成化的優勢.已有研究利用LAMP 技術設計芯片，可以一次性檢測水體致病菌的多個毒力和標記基因[35]；通過將LAMP 技術與MPN(most probable number)方法結合構建微芯片，可以在不需要提取核酸的情況下直接檢測水體中的致病菌[36].微流控芯片與實時成像系統的結合可能成為開發廉價便攜的現場篩查多種環境水體致病菌的關鍵技術.已有研究通過基于LAMP 技術的微芯片與低成本的電荷耦合器件熒光成像系統相結合，能夠更加便利地快速檢測6 種環境水體致病菌[37].LAMP 技術與微流控芯片相結合可以縮短檢測耗時，降低檢測限(見表1).一般檢測耗時小于20 min[35-37]，是商業PCR 方法檢測時間的一半，檢測限低至1 copy/樣本[32]或<10 CFU/樣本[36].總體上，LAMP 技術是一種快速、敏感且低成本的致病菌診斷系統，但其引物設計復雜，需要研究人員針對不同致病菌現行建立標準化的檢測流程用以推廣應用(見表2).

1.7 基因編輯技術

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相關的蛋白系統是自然界中細菌和古細菌抵御噬菌體感染和質粒轉移的一種防御機制[19].基因編輯技術依賴于CRISPR RNA(CrRNA)引導的Cas12a(DNA)和Cas13(RNA)酶的切割能力[8].為了檢測切割反應，可以與熒光探針、膠體金試紙條等方法聯合應用.由于CRISPR/Cas 系統具有特異性好、靈敏度高、檢測便捷等優點，再加上Cas12a 對DNA具有靶向性，因此近年來已有研究將CRISPR/Cas12a系統應用在環境水體致病菌的早期診斷和現場快速檢測等領域[8,38-39,53].

CRISPR/Cas12a 系統通常與其他技術結合來實現對致病菌的檢測.結合CRISPR/Cas12a 與可逆閥輔助芯片，可快速便捷地檢測副溶血性弧菌[38].通過優化裂解緩沖液、LAMP 試劑和CRISPR 試劑，從采樣到獲得結果可以在50 min 內完成[38].結合重組酶輔助擴增檢測和CRISPR/Cas12a 系統可快速敏感地診斷創傷弧菌[39]和致病大腸桿菌O157∶H7[8].利用CRISPR/Cas12a 放大熒光信號，可以實現超高靈敏度的致病菌檢測，如檢測限達到2 copies/樣本的創傷弧菌[39]和1 CFU/mL 的大腸桿菌O157:H7[8].結合LAMP和重組酶輔助擴增等恒溫擴增方法與CRISPR/Cas12a技術，無需復雜儀器，且檢測迅速，低至40 min(見表1)[39].然而，基因編輯技術需要事先了解目標致病菌的基因組序列，其CRISPR/Cas 系統的設計需要專業技術人員(見表2).

2 介水傳播疾病的定量微生物風險評估

2.1 QMRA 評估方法

QMRA 是一種系統的定量評估過程，被用于估計人類暴露于特定病原微生物時的健康風險或疾病發病率.該方法結合了感染的劑量-反應信息和暴露途徑的分布信息，能夠確定飲用水分配系統是否達到健康目標.這些健康目標建議每年每萬人感染率小于1 次，或者每人每年患病負擔為10-6傷殘調整壽命年(disability adjusted life year)[54].QMRA 有助于預測介水傳播疾病的風險，設定可接受的介水傳播疾病每年每萬人感染率限制，找出降低疾病感染風險的方法，并確定保護水安全的措施.

風險評估包括風險識別、暴露評估、劑量-反應評估、風險表征和風險管理及溝通5 個步驟(見圖2).其中病原菌的暴露途徑主要為經口攝入，也有部分病原菌通過眼睛接觸傳染[55]，據此，通過水中致病菌豐度與單位時間內暴露體積及單次暴露時間長度的乘積計算暴露劑量(D)，根據不同致病菌的劑量-反應模型分別計算Pd(每日感染概率)，則年度感染概率Py=1-(1-Pd)f，其中f為暴露頻率(d/a)[56].相比于定性評估方法，QMRA 提供了更準確、可比較的結果，有利于決策者理解和比較不同風險源的風險水平，并制定管理策略.

圖2 定量微生物風險評估(QMRA)流程圖Fig.2 Flow diagram for quantitative microbial risk assessment (QMRA)

2.2 QMRA 在環境水體致病菌風險評估中的應用

QMRA 依賴于水中致病菌的監測方法，目前QMRA 方法主要基于通過培養方法獲得的數據，已經被用于評估不同天氣條件下沖浪和游泳后海灘娛樂水域[57]、受人源和非人源糞便污染的娛樂水體[58]、受污染的城市洪水[59]以及低收入地區較差的飲用水水質[60]所帶來的公共健康風險.然而，僅依靠培養方法無法完全表征風險，因為存在VBNC 狀態的細菌[61]，而且許多環境水體致病菌在自然樣本中很難甚至無法被培養出來.此外，一些培養方法可能無法區分致病菌的基因型，如使用常規的大腸桿菌培養基無法區分出O157:H7 株型.

隨著分子生物學方法在微生物檢測中的廣泛應用，如何有效利用這些數據來進行QMRA 變得至關重要[62].有研究應用qPCR 定量分析的城市景觀娛樂水體中致病菌豐度數據進行了QMRA[55].然而，目前針對不同致病菌的劑量-反應模型參數多是根據傳統培養法進行擬合獲得的，由于qPCR 分子生物學方法可以檢測到水體中非活性的病原體，可能過高地估計了水中可傳播的致病菌數量，從而導致qPCR 方法計算的感染概率偏大，因此需要進行相應的修正或者針對新型分子生物學檢測方法重新建立劑量-反應模型.

2.3 應用分子生物學快速檢測技術進行QMRA 的優勢和不足

運用分子生物學技術可以更準確地識別致病菌，并在較短的時間內檢測到活性微生物，改進對致病菌的表征.相比傳統培養方法，除致病菌濃度外，還能夠將監測方法所提供的關于致病菌發生、傳播程度、毒力乃至存活力等關鍵信息應用于QMRA 結果的評估中.另外，人力進行QMRA 不能實時評估，而分子生物學技術檢測結果多為電子數據，有利于直接創建可訪問的數據，結合人工智能模型評估不同致病菌的風險水平，可以實現對區域范圍的自動預警，從而提高QMRA 的可行性和應用性.目前，運用分子生物學快速檢測技術進行環境水體致病菌QMRA 的主要限制之一是缺乏可用于評估的數據，因此建議在全國范圍內設立重點監測站點，以收集長期的監測數據，從而提高預測致病菌污染和保護公共健康的可能性[63].

3 結論與展望

a) 與傳統培養方法相比，分子生物學方法在環境水體致病菌的檢測方面具有靈敏度高、特異性好和耗時短的優勢，但仍然需要進一步降低檢測耗時，減少昂貴設備的使用和對操作人員的技術培訓要求，同時降低分析成本.

b) 污水、地表水和海水中的腐殖酸、氯化鈉等抑制性物質會影響以PCR 為基礎的檢測技術的擴增效率，需要優化；而飲用水和水源水中致病菌豐度較低，宜應用高靈敏度的檢測技術.

c) 分子生物學方法在高通量檢測致病菌、檢測VBNC 的菌株以及區分致病毒株和非致病菌株等方面具有不可替代的優勢.因此，有必要將這些非傳統的致病菌特征納入到QMRA 結果的評估中，通過優化QMRA 評估模型，提高對致病菌污染的預測能力.

d) 盡管已有大量研究建立起了不同致病菌的分子生物學檢測方法，然而目前相關水環境質量標準中并未對除了指示微生物以外的致病菌提出明確的檢測要求.因此，在環境水體樣本致病菌的實際檢測中，相關分子生物學技術的應用相當有限，亟需制定水環境中更加廣泛的致病菌檢測標準.

e) 當前，全球范圍內水環境中生物污染事件頻繁發生，對人體健康構成嚴重威脅.應當將人工智能引入公共衛生預警系統中，利用大數據分析和人工智能模型實現自動快速預警，從而更好地預測和應對水環境中的生物污染事件.