生物質炭施用對水稻土有機質分子結構和組成的影響

宋凱悅，劉志偉，劉 偉，馬睿凌，李世賢，卞榮軍，鄭聚鋒*，潘根興

1.南京農業大學農業資源與生態環境研究所，江蘇 南京 210095

2.江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，江蘇 南京 210095

土壤有機碳(SOC)庫是陸地生態系統最大的有機碳庫，在調節土壤功能、保障作物產量與減緩氣候變化等方面發揮著重要作用[1].據估算，全球表層土壤(0～20 cm)SOC 儲量約為615 Pg[2]，若深度延伸至1 m，其儲量達1 500 Pg[3].盡管深層土壤(20～100 cm)SOC 密度較低，但因儲量巨大，其微小變化將對全球生態系統碳循環過程產生重大影響[4].在過去20 年間，表層SOC 動態已經受到了極大的關注[5-6]，但有關深層SOC 庫動態的認識還相對不足[7].因此，研究深層SOC 動態對于認識土壤碳循環過程、促進土壤固碳與減緩氣候變化具有重要意義.

生物質炭(BC)是生物質材料在完全厭氧或部分限氧條件下熱解而成的高度芳香化的固態富碳物質[8]，其作為土壤改良劑，具有改善土壤肥力、提高有機質含量與作物產量以及降低溫室氣體排放的作用[8-10].已有研究[11-14]表明，BC 施用影響表層土壤有機質的轉化、分子組成和結構.例如，龍杰琦等[13]利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術研究發現，長期(9 年)玉米秸稈炭添加促使全土和大團聚體內有機質結構趨于脂肪化，且增強了微團聚體中有機質的穩定性；Chen 等[14]利用連續提取-氣質聯用(GC/MS)的方法分析了玉米秸稈炭施用2 年后稻田表層土壤有機質分子組成變化，發現BC 處理增強了表層土壤活性碳庫中分子和官能團的多樣性，而且提升植物源有機質分子(主要是脂類)的含量.此外，BC 施用于土壤后，以縮合芳香環結構為主的碳源結構會發生氧化裂解，產生可溶性有機碳(DOC)[15]，同時，物理崩解生成的炭顆粒(納米級)，在田間灌溉和降雨的作用下，將進一步影響其在土壤剖面中的遷移[16-17].然而，目前關于深層土壤有機質分子結構和組成對表層土壤BC 添加的響應認識還相對不足.

水稻土是我國一種獨特的水耕熟化人為土壤，稻田農業是保證我國糧食安全的主要支撐.同時，水稻土還具有較高的碳密度，對農業碳庫的貢獻不可小覷[18].由于長期受水分管理的影響，水稻土表層施用BC 可能因水分運動而影響深層SOC 庫的組成[19]，因此，本研究以BC 改良4 年后的水稻土為研究對象，采用FTIR 和Py-GC/MS 技術對土壤有機質分子結構和組成進行分析，從定量和定性角度探究BC 施用下不同深度土壤有機質分子結構和組成的變化，這對于認識和評估不同深度土壤中BC 的固碳效應及預測未來碳庫變化具有重要意義，同時也為農業廢棄生物質資源合理利用提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

BC 田間試驗開始于2016 年，地點位于江蘇省宜興市(31°41′N、119°73′E).該地區屬亞熱帶濕潤季風氣候，年均降水量1 177 mm，年均氣溫15.7 ℃.土壤類型為第四紀湖積物發育的典型脫潛型水稻土，該地區傳統的種植制度為稻-麥輪作.供試土壤基本性質：SOC 含量23.06 g/kg，全氮(TN)含量1.87 g/kg，速效磷含量19.53 mg/kg，速效鉀含量129.7 mg/kg，pH=5.70，容重1.32 g/cm3.

1.2 試驗設計

田間試驗包含兩個處理：對照(CK)和施用生物質炭(BC)處理.采用完全隨機區組設計，每個處理3次重復，各小區面積為30 m2(5 m×6 m)，且各小區間由0.5 m 寬的緩沖區進行分隔.所用BC 為玉米秸稈在450 ℃限氧條件下熱解得到，其基本性質：有機碳含量413.0 g/kg，TN 含量7.97 g/kg，速效磷含量2.36 mg/kg，pH=8.79.在2016 年水稻種植前BC 按15 t/hm2的用量一次性均勻施入土壤表層，并翻耕均勻至0～15 cm.水分管理、耕作、施肥等均遵循當地田間管理措施.

1.3 土壤樣品采集

2020 年6 月小麥收獲后，在田間挖取剖面，依據水稻土發生層次劃分為耕作層(A 層，0～15 cm)，犁底層(Ap 層，15～28 cm)和潴育層(W 層，28～50 cm)，分別在每個小區3 個土層中按5 點法隨機取樣.新鮮土樣經充分混合后儲存于不銹鋼罐運回實驗室.在土壤樣品處理前，剔除可見的植物殘體和石礫，然后將采集的樣品過2 mm 篩后分為兩份：一份進行自然風干，用于土壤理化性質和有機質分子組成測定；另一份用于土壤DOC 含量分析.

1.4 土壤基本性質測定

土壤和BC 的理化性質分析參照魯如坤[20]描述的方法.有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；TN 含量采用半微量開氏法測定；土壤pH 采用pH 計測定(水土比為2.5∶1)；土壤容重采用環刀法測定；速效磷含量采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用NH4OAc 浸提-火焰光度法測定；DOC 含量采用水浸提-TOC 分析儀(multi N/C 2100，德國)測定.

1.5 土壤紅外光譜分析

將土壤樣品在45 ℃烘箱中烘干，盡可能降低水中羥基對測試結果的干擾[21].將2.0 mg 土樣和200 mg 光譜純溴化鉀置于瑪瑙研缽中充分研磨過篩，混勻后壓片.使用傅里葉紅外光譜儀(Nicolet 6700 FTIR，美國)進行樣品掃描，紅外光譜測試范圍介于400～4 000 cm-1之間，樣品測定前，用溴化鉀壓片來扣除背景.表1 顯示了該研究光譜中觀察到的吸收峰和文獻報道中吸收帶的官能團分配.

表1 紅外吸收峰的主要歸屬Table 1 Main attributions of infrared absorption peaks

1.6 土壤有機質分子組成分析-熱裂解氣相色譜-質譜法

根據Spaccini 等[26]描述的方法并稍加修改，采用四甲基氫氧化銨(TMAH)對樣品進行甲基化，再通過離線熱裂解-氣相色譜質譜聯用(Off-line Py-GC/MS)處理分析.簡言之，稱取1.0 g 研磨過100 目篩的土壤樣品于石英槽中，移液槍緩慢加入1 mL 25% TMAH溶液(溶于甲醇)使土壤均勻潤濕，對樣品進行甲基化，然后置于真空干燥器中過夜.干燥后的樣品與石英槽一同放入耐高溫玻璃管中，并放入裂解爐進行有機質熱裂解.將熱解爐升溫至400 ℃并保持30 min，以氦氣(30 mL/min)為載氣，裂解產物由氦氣流載出，依次進入兩個分別裝有100 mL 氯仿的圓底燒瓶，該裝置用于收集熱解產物.待裂解爐完全冷卻后，將含有熱裂解產物的氯仿溶液混合后進行旋轉蒸發，再用不超過2 mL 的色譜純氯仿溶液將樣品復溶后轉移至1 mL 的玻璃瓶中，采用氮氣吹干.最后加入100 μL 十九烷酸(1 000 mg/L)內標和900 μL 色譜純氯仿將樣品再次復溶后轉至色譜進樣瓶，采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS，Agilent 7890，美國)進行分析.

將TurboMass Ver 4.5.0 與Agilent Masshunter NIST 17.0 數據庫結合，根據質荷比(m/z)，在每個土壤樣品中均鑒定出170 多種熱解產物.利用來自特征數據集的Py-GC/MS 經驗公式，基于其H/C 和O/C比率生成Van Krevelen 圖.熱解產物的相對百分比是將第1 個對照處理設定為100%，然后在對照值的基礎上進行歸一化.根據Py-GC/MS 分析結果計算得到有機質分子相對豐度，再對熱裂解產物獲得的分子按官能團類型進行分類.其中，醇類(AC)、氨基化合物(AD)、胺類(AM)和脂肪族酯(ES)屬于不穩定類化合物，多酚類(PH)和雜環氮化合物(HN)屬于亞穩定類化合物，烷烴類(AL)和醚(ET)屬于最穩定化合物[27].

1.7 數據處理

采用SPSS 26 軟件進行單因素方差分析(Duncan′s post-hoc 檢驗，P<0.05)，確定同一處理不同土層間指標差異的顯著性，通過t檢驗比較同一土層不同處理間的差異顯著性(P<0.05).采用Origin 2018 軟件對紅外光譜圖像進行吸光度轉化、圖像光滑和基線校準.

2 結果與討論

2.1 生物質炭施用下不同深度SOC 和DOC 含量的變化

圖1 所示，與CK 處理相比，BC 處理的A 層SOC含量增加了13.0%，然而，BC 與CK 處理之間Ap 層和W 層SOC 含量無明顯差異，表明BC 施用能顯著促進表層土壤固碳.究其原因主要是：①BC 富含惰性有機碳，其進入土壤不僅可以增加SOC 含量，而且還提高對生物降解的抵抗力[9,28]；②BC 在表層土壤中長期存在增強了對SOC 的物理保護作用.由于BC具有較高孔隙度和較強吸附能力，SOC 被吸附于BC孔隙或BC 表面，這阻隔了孔隙內的SOC 與微生物及其胞外酶的接觸[29-30]，隨著BC 的老化，BC 表面的羧基可能進一步增強有機-BC-礦物的相互作用，從而促進了土壤團聚體形成而增強了土壤對原SOC 的物理保護作用，進而抑制了對原SOC 的分解(即產生負激發效應)[31-32].③BC 施用因提高肥力而促進植株和根系生長，這將增加植物源碳向表層土壤的輸入量，因而可以促進表層土壤碳固定[6].然而，由于稻田土壤中存在致密的Ap 層，植物根系、BC 碎片等有機物進入表層，除了易分解部分被快速礦化外，難降解部分或大顆粒部分的縱向淋失量也較少[33]，因而在深層土壤(Ap 層、W 層)SOC 總量的變化不明顯.

圖1 不同處理下各土壤深度SOC 和DOC 含量Fig.1 SOC and DOC contents at different soil depths under different treatments

DOC 是土壤碳庫中最活躍的碳組分，在土壤生物地球化學過程中發揮著重要作用，其含量變化與有機質輸入及微生物利用密切相關[12,34].本研究中，與CK 處理相比，BC 處理的A 層和Ap 層DOC 含量分別顯著增加22.3%和20.8%，但對W 層DOC 含量影響不顯著.由于BC 的施用年限較長，本身的活性組分已被分解，因此，A 層和Ap 層中DOC 含量增加主要歸因于BC 長期施用后的間接效應.研究表明，BC改良土壤能提高植物根系生物量并能產生較多的根系分泌物[35]，而且根系生長可能破壞大團聚體，釋放其中的活性有機碳，這些有機物均可能成為土壤DOC 潛在的來源[36].He 等[36]研究表明，活根及其分泌物破壞了土壤有機質超分子的穩定性，從而提高了土壤DOC 含量.因此，長期BC 施用影響下的根際過程可能是土壤A 層和Ap 層中DOC 釋放的重要驅動因素.然而，受碳源限制，深層土壤微生物對碳的需求高于表層[37]，雖然BC 施用提高了W 層土壤DOC 的輸入，但其作為易分解碳源在淋溶過程中易被微生物迅速利用，因此，W 層土壤DOC 含量未發生顯著變化.

2.2 生物質炭施用下不同深度土壤有機質紅外光譜分析

如圖2 所示，隨土壤深度的增加，1 432 cm-1處的吸收峰逐漸增強，表明芳香族化合物的相對豐度在逐漸增加.這主要是因為表層土壤有機質在好氣條件下礦化率較高，隨著土壤深度增加，土壤中氧氣含量逐漸降低，多酚氧化酶活性受到抑制，導致芳香族物質(如木質素)的富集，因而增加了深層土壤1 432 cm-1處的相對峰強度[23].

圖2 不同處理下各深度土壤的紅外光譜特征Fig.2 Infrared spectral characteristics of soil at different depths under different treatments

中紅外光譜分析表明，長期BC 施用增強了土壤有機質化學組成的穩定性.與CK 處理相比，BC 處理增強了各土層1 635 cm-1處吸收峰相對強度，而A 層和Ap 層中1 034 cm-1處吸收峰相對強度有所降低.這表明BC 施用增加了各土層芳香族碳組分的相對峰強度，即更穩定的有機化合物產生富集[23]；而纖維素等多糖中C-O-C 鍵的拉伸振動減弱，即不穩定碳水化合物有所降低[25]，這些結果進一步表明BC 長期施用降低了土壤碳代謝，這可能是其增強土壤碳庫穩定性的一個重要機制[38].這是由于BC(玉米秸稈)本身含有較多的羧基碳[27]，而且富含高度濃縮的芳香環結構，生物穩定性強，因而施入土壤后難降解性芳香族化合物的相對豐度得到提高[8]；同時，BC 可能促進了芳香族化合物的向下遷移，進入深層土壤的芳香族物質易與鐵氧化物發生絡合反應，不易被微生物接觸利用[39].因此，1 635 cm-1處吸收峰相對強度在BC處理下明顯增加.此外，BC 中豐富的孔隙結構和較大比表面積，為微生物的生長代謝提供了良好的生存環境，微生物活性及代謝能力增強，加快了土壤中植物源的糖類、氨基酸等活性物質的分解，這可能導致了多糖及碳水化合物峰強度的相對下降[15].

2.3 生物質炭施用下不同深度土壤有機質分子組成的變化

利用Py-GC/MS 技術對不同深度土壤有機質分子組成進行分析，發現水稻土有機質分子豐度隨土層深度的增加而降低(見圖3).土壤有機質組分的O/C在0～0.5 之間，O/H 在0.6～2.1 左右.參考Van Krevelen圖[40]劃分標準，本研究區土壤有機質分子組成以脂質及高度不飽和脂質化合物為主，化合物類型主要為脂肪族乙醇、脂肪酸、氨基化合物、烷烴類等.醇類、氨基化合物、胺類、脂肪族酯、脂肪酸、雜環氮化合物、苯酚酯和多酚類這8 種化合物在總成分中占比超過80%(見圖4).在CK 處理中，隨土壤深度的增加，烷烴類、雜環氮化合物、苯酚酯和多酚類相對豐度呈增加趨勢，而氨基酸、醇類、氨基化合物、胺類、糖類等物質的相對豐度呈降低趨勢.在BC 處理中，上述官能團表現出相似的變化規律，即不穩定組分隨土層深度的增加而降低，較穩定組分的相對豐度則高于表層(見圖4).其中，烷烴類相對豐度的增幅較大.研究表明烷基碳來源于植物生物聚合物(角質和蠟)和微生物代謝產物，其疏水性與土壤中難降解有機質組分密切相關[41]，并且其比例隨土壤深度的增加而增加[42]，烷基化合物的留存擴大了土壤有機質中疏水性區域，進而增強了SOC 的封存[41].同時，稻田土壤微生物可能對氨基酸和胺類的利用較高[27]，被微生物難利用的疏水性分子和芳香化合物相對豐度則隨土壤深度的增加而增加，因而土壤有機質分子組成趨于穩定.

圖3 熱解GC/MS 鑒定的有機質分子組成Van Krevelen 圖Fig.3 Van Krevelen plot of molecular composition of organic matter identified by pyrolysis GC/MS

圖4 熱解GC/MS 鑒定的化合物類別歸一化相對豐度Fig.4 Normalized relative abundance of compound classes identified by pyrolysis GC/MS

與CK 處理相比，BC 施用增加了各深度土壤有機質分子豐度，并且BC 施用下的土壤有機質分子組成中仍以脂質及高度不飽和脂質化合物為主，但木質素衍生的化合物及縮合芳香化合物豐度較對照處理有所增加(見圖3).在A 層土壤中，BC 處理的烷烴類、胺類、脂肪酸、雜環氮化合物、苯酚酯和多酚類相對豐度較CK 處理顯著增加，增幅分別為127.8%、52.4%、12.0%、37.8%、76.6%和30.2%.而在Ap 層和W 層土壤中，BC 處理的烷烴類、胺類、雜環氮化合物、苯酚酯及多酚類的相對豐度較CK 處理也有明顯增加，但增幅有所下降(見圖4).這主要存在以下原因：首先，BC 施用于土壤后釋放出的自身胺類物質能在土壤中穩定滯留[27].并且BC 富含由脂肪族和含氧官能團連接的穩定芳香化結構[43]，這些高度芳香化結構和疏水性脂肪族碳的存在使BC 的生物穩定性強，因此可以在環境中長期留存且不易被礦化[44]，這可能是深層土壤中苯酚酯及多酚類相對豐度較高的重要原因.再者，BC 輸入可能增加了深層土壤中植物、動物和微生物源的難降解性脂肪族碳的相對豐度，這是因為生物大分子之間能夠形成抑制酶降解的化學鍵，或是非酶聚合過程將低分子量脂質轉化為脂肪族大分子[45].本研究中，A 層土壤的氨基酸、氨基化合物、二元羧酸、羥基酸和糖類的相對豐度在BC 處理下分別降低73.7%、38.2%、56.6%、50.6%和70.9%.而BC 處理的Ap 層和W 層土壤中氨基酸、氨基化合物、脂肪族酯、羥基酸的相對豐度則大幅降低，特別是W 層，BC 處理下氨基酸、二元羧酸、固醇類和糖類等官能團均未檢測到(見圖4).已有研究表明，BC 施用能夠提高微生物活性以及對羰基酸和羥基酸的利用能力[46]，從而降低深層土壤中碳水化合物和羧酸等不穩定組分的相對豐度，進而提高了深層碳庫的穩定性.

3 結論

a) BC 一次施用對水稻土有機碳庫及分子組成的影響在4 年尺度上具有持續效應且因土壤深度而異.BC 施用主要增加了耕作層(A 層)中SOC 的含量以及耕作層(A 層)、犁底層(Ap 層)中DOC 的含量.

b) 不同深度土壤有機質分子結構、組成對表層BC 施用呈現不同響應.BC 施用使得各深度土壤有機質結構中芳香族C=C 吸收峰強度增加，土壤耕作層(A 層)和犁底層(Ap 層)中多糖C-O-C 吸收峰強度減弱，土壤有機質結構趨于芳香化；并且剖面芳香性和疏水性化合物的相對豐度因BC 施用而增加，氨基酸、氨基化合物、二元羧酸、羥基酸和糖類等不穩定組分大幅降低.因此，BC 在水稻土表層施用有助于增強深層土壤有機質穩定性.