高效液相色譜-串聯質譜法測定松樹木材中阿維菌素的殘留量

王奕升，張錚鈺，徐 勇，周 楊，吳蘭鑫，王 真，張紅艷，吳學民

（中國農業大學理學院應用化學系農藥研究中心，北京 100193）

阿維菌素別名為阿巴美丁、阿佛菌素、殺蟲素等，是一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環內酯化合物，由鏈霉菌發酵產生。其具有很強的胃毒作用和觸殺作用，對昆蟲和螨類均有較好的效果，其中對植物線蟲的活性較高，發展前景十分廣闊［1］。阿維菌素于1976 年被美國默克公司分離提取之后便被深入研究，中國從20 世紀80 年代末也開始研究阿維菌素，應用范圍廣泛，作為一種殺線蟲劑，登記農藥已達82 種［2］。

阿維菌素可以通過影響害蟲的神經生理活動，導致神經膜電位極化阻斷神經傳導以殺滅害蟲［3，4］，其對松樹病害的防治具有重要意義。松樹在中國分布范圍廣泛，是一種重要的林業資源，同時被列為國家戰略儲備樹種。松樹可以在不同環境中生長，對土壤的要求較低，能忍耐較為瘠薄的土地，對水需求小，喜好陽光。松樹在生長過程中，容易受到病蟲害的影響，且影響程度較大，因此防治病蟲害并保護松樹具有重要的意義。松樹常見的病蟲害包括松毛蟲、松材線蟲病、松褐天牛、松干蚧殼蟲、松梢螟等，其中松材線蟲病對松樹的危害最大，被稱為松樹的“癌癥”，松樹在感染40 d 左右便會死亡［5-7］，其傳播速度極快，對松樹的致死效果極強，并且難以控制［8］。而阿維菌素能夠有效抑制松材線蟲病，具有較強的殺線蟲活性［9］。防治松材線蟲病的方式之一是向樹干打孔注藥，適用于古樹名木以及公園、景區等區域內松樹的重點保護。為了解阿維菌素在松樹樹干中的傳輸過程，需要建立快速、準確檢測其在松樹中殘留的方法。

關于阿維菌素的測定方法以液相色譜法為主，分為高效液相色譜-二極管陣列檢測法（HPLCPDA）、高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD）、高效液相色譜紫外檢測法（HPLC-UV）、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）等［10］。

本試驗將圍繞建立一種利用高效液相色譜-串聯質譜儀測定松樹木材中阿維菌素殘留量的方法展開，以期為測定阿維菌素的殘留量并保證殘留安全提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DFY-500C 型粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；液相色譜儀-質譜儀［島津（香港）有限公司］；低速臺式大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；HC-2517 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；VORTEX-5 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；UMV-2 型多管漩渦混合器（北京優晟聯合科技有限公司）；JY2002 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；JA2003B 型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；AUW220D 型電子天平（日本島津制作所）；移液槍（德國Eppendorf公司）。

松樹木材樣品；阿維菌素標準品（純度96.6%，上海市農藥研究所有限公司）；C18（天津博納艾杰爾科技有限公司）；硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical 公司）；氯化鈉、甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司）。

1.2 試驗處理

準確稱取阿維菌素標準品0.005 2 g，用乙腈溶解，轉移至50 mL 容量瓶中，并用乙腈定容至刻度線，混合均勻，得到100 mg/L 的標準儲備溶液。向10 mL 容量瓶中準確加入100 mg/L 的阿維菌素標準儲備溶液1.0 mL，并用乙腈稀釋定容至刻度線，混合均勻，得到10 mg/L 的阿維菌素標準工作溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取與凈化

1）提取。松樹木材樣品經粉碎機粉碎混勻后備用。準確稱取1.00 g 木屑樣品，加入到50 mL 具塞離心管中，并加入10 mL 乙腈、5 mL 水、3 g 氯化鈉，于渦旋混合器中渦旋振蕩提取阿維菌素5 min，以3 800 r/min 離心5 min。

2）凈化。移取1 mL 提取液置于裝有50 mg C18和100 mg 硫酸鎂的2 mL 離心管中，渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min 離心1 min，上層清液（乙腈相）經0.22 μm 有機系濾膜過濾后用液相色譜儀-質譜儀分析，使用外標法定量。

1.3.2 高效液相色譜-串聯質譜儀操作條件

1）液相色譜條件。色譜柱為Athena C18-WP 柱（3.0 μm×2.1 mm×50.0 mm），流動相A 為乙腈，流動相B 為0.1%甲酸水溶液，A∶B=8∶2（V/V）；流速為0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃；采用等度洗脫。

2）質譜條件。離子化方式為電噴霧離子源，ESI+；加熱塊溫度400 ℃；離子傳輸線溫度200 ℃；離子源溫度300 ℃；加熱氣流速10 L/min；霧化氣流速2 L/min；干燥氣流速10 L/min；駐留時間30 ms；檢測方式為多離子反應監測（MRM）；目標化合物質譜參數如表1 所示。

表1 目標化合物質譜參數

1.3.3 方法的線性范圍 為避免基質效應對試驗的影響，采用基質加標配制阿維菌素標準品以及外標法定量的方法。按照“1.3.1”的方法對空白木屑樣品進行提取、凈化，得到空白基質提取液。配制基質標準系列溶液，濃度分別為0.005、0.010、0.100、0.500、1.000 mg/L。采用“1.3.2”中的儀器條件，以橫坐標為濃度、縱坐標為定量離子對的峰面積值，繪制標準曲線方程，計算線性決定系數（R2）。

2 結果與分析

2.1 樣品提取優化

由于暫無從松樹木材中提取阿維菌素的案例，因此該試驗參考從蔬菜水果中提取阿維菌素所使用的溶劑。根據文獻報道［11-18］，甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用溶劑均可用于提取阿維菌素，因為松樹與水稻秸稈中均含有油脂，成分類似，且常用乙腈提取水稻秸稈中的阿維菌素，所以本試驗也采用乙腈作為溶劑提取松樹木屑中的阿維菌素。

常用農藥殘留分析凈化劑的選擇以C18、PSA為主，凈化劑的種類與用量通過基質的改變而產生不同的基質效應，影響方法的回收率。該試驗分別使用50 mg PSA，30、50、80 mg C18，25 mg C18 與25 mg PSA，50 mg C18 與50 mg PSA 共6 組作為凈化劑，比較不同凈化劑對回收率的影響，結果表明，6 組回收率在79%～101%，均滿足農作物中農藥殘留試驗準則中的要求。比較凈化劑種類與用量對基質提取液中雜質含量的影響。結果表明，不同基質提取液中雜質對阿維菌素的影響大致相同。比較凈化劑種類與用量對阿維菌素響應值的影響，結果表明，單獨使用C18 作為凈化劑時阿維菌素響應值最大，因此單獨使用C18 作為凈化劑時阿維菌素的檢出限最低，效果最好。基于上述各方面比較考慮，選擇C18作為凈化劑最佳，用量為中間值50 mg。

2.2 色譜條件優化

根據文獻報道［14，19，20］，液相色譜流動相的選擇包括乙腈和甲酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等，本試驗采用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為液相色譜的流動相，不同比例的流動相對阿維菌素的保留時間、峰形、響應值等都有一定的影響，為了提高阿維菌素的電離效率，通過改變乙腈和0.1%甲酸水溶液的比例確定最佳色譜條件。結果表明，0.1%甲酸水溶液所占比例越大，阿維菌素的保留時間越長，響應值越大。為保證靈敏度，選擇乙腈∶0.1%甲酸水溶液=8∶2（V/V），若再增大0.1%甲酸水溶液所占比例，響應值會增大，但是阿維菌素的保留時間過長，造成時間的浪費，不符合本試驗的要求。

2.3 線性范圍及方法定量限

阿維菌素的基質標準溶液色譜（0.1 mg/L）分布如圖1 所示。由圖1 可知，阿維菌素的色譜峰峰形良好，對稱性高，其他雜質影響較小。阿維菌素的線性方程為y=485 936x+6 347.4（R2=0.997 6），結果表明，阿維菌素濃度在0.005～1.000 mg/L 范圍內線性關系良好。

圖1 阿維菌素的標準溶液色譜（0.1 mg/L）分布

2.4 精確度與準確度

對空白松樹木材樣品分別進行0.1、1.0、5.0 mg/kg添加回收率的試驗，每個濃度重復5 次，靜置30 min后，其余操作同“1.3.1”并采用基質匹配標樣校正法測定，計算阿維菌素的平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2 可知，阿維菌素在松樹木材樣品中3 個水平添加濃度的平均回收率為77%～86%，回收率的相對標準偏差為2.0%～8.0%，方法重現性較好，準確度和精確度均滿足要求。該方法的定量限為最小添加濃度0.1 mg/kg，滿足檢測的要求。

表2 方法平均回收率與相對標準偏差（n=5）

3 小結

該試驗建立了改進的QuEChERS 前處理方法，并結合高效液相色譜-串聯質譜儀檢測松樹木材中阿維菌素殘留量，采用基質標準溶液外標法定量，該方法樣品前處理快速高效、準確度高、靈敏度高，可以用于檢測松樹木材中阿維菌素的農藥殘留，為監測松樹中阿維菌素的殘留量提供了理論依據，對保障松樹的健康與人類的安全有重要意義。