基于生物信息學(xué)與相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究ACLY與食管癌的關(guān)系

王 萌，張陽(yáng)陽(yáng)，劉 靜

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科（武漢 430071）

食管癌作為世界范圍內(nèi)發(fā)病率第七和致死率第六的癌癥，是威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，尤其在弱勢(shì)人群中，食管癌危害性相對(duì)更高[1]。全球疾病負(fù)擔(dān)研究（GBD）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，全球因食管癌死亡的人數(shù)從1990年的319 332人增至2019年的498 067人，相對(duì)增幅達(dá)55.97%[2]。根據(jù)全球癌癥觀(guān)察2020年線(xiàn)上平臺(tái)（GLOBOCAN 2020）數(shù)據(jù)，全球食管癌病例數(shù)攀升至60.41萬(wàn)，占所有癌癥的3.1%，2020年每18例由于癌癥死亡的病例中就有1例與食管癌相關(guān)[3]。有數(shù)據(jù)顯示，50%以上的食管癌發(fā)病患者位于中國(guó)，國(guó)內(nèi)食管癌的組織學(xué)亞型中，鱗狀細(xì)胞癌占比90%以上[4]。因此，深入研究食管癌的發(fā)病機(jī)制并尋找相關(guān)腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。

ATP-檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是脂肪酸生物合成中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將檸檬酸以及輔酶A催化為乙酰輔酶A及草酰乙酸[5]。ACLY主要分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)以及細(xì)胞核中[6]，其異常增多與多種惡性腫瘤有關(guān)，比如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、宮頸癌、骨肉瘤和肺癌[6-8]，此外，ACLY在肺腺癌以及急性髓系白血病中提示了不良的預(yù)后[9-10]。目前，ACLY在食管癌中發(fā)揮的作用尚未有研究。本研究利用TCGA、UALCAN等數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)采用生物信息學(xué)技術(shù)以及CCK8細(xì)胞增殖、平板克隆等體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)食管癌組織中ACLY分子的功能進(jìn)行分析，以期為食管癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

在線(xiàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）、癌癥數(shù)據(jù)在線(xiàn)分析（UALCAN）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu）、基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancerpku.cn/）。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

食管癌細(xì)胞系EC109購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)（目錄號(hào)：1101HUM-PUMC 000246）。用含10%胎牛血清（FBS）（Gibco，美國(guó)）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Servicebio，中國(guó)）培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為siNC組、siACLY#1組、siACLY#2組，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ACLY siRNA兩條序列（siACLY#1，GCTCGATTATGCACTGGAA；siACLY#2，GACCA AAGATGGAGTCTAT）及其陰性對(duì)照（siNC）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成和提供。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 8000（碧云天，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為vec組以及oeACLY組，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。pcDNA3.1(+) 以及pcDNA3.1(+) -ACLY購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

根據(jù)Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，日本）說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Roche，瑞士）檢測(cè)目的基因（GAPDH-R：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG；GAPDH-F：ACCACCCTGTT GCTGT AGCCAA；ACLY-R：AACTTTGCCTCTCTCCGC；ACLY-F：GATGGTCACTCCCTT CTG）表達(dá)水平。

1.5 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

預(yù)冷的NP40蛋白裂解液（碧云天，中國(guó)）冰浴裂解抽提蛋白，于4℃、12 000 r/min條件下離心20 min后取上清，按BCA試劑盒（碧云天，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后取30 μg加入至10%Bis-Tris膠（GE Healthcare，美國(guó)）中電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入抗體ACLY（15421-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；稀釋比1 ∶ 2 000）、p21（25614-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；稀釋比1 ∶ 2 000）、p27（10355-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；稀釋比1 ∶ 2 000），4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（Servicebio，中國(guó)；稀釋比1 ∶ 5 000）后室溫下孵育2 h，TBST再次洗膜3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)目的條帶。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力

將處理后的EC109細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種約2 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，按照CCK-8試劑盒（Biosharp，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)加入CCK-8試劑，孵育2 h后在酶聯(lián)儀（BioTek，美國(guó)）上測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD Value）。

1.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)

取處理后的EC109細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500個(gè)。培養(yǎng)10～14 d后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS清洗后用0.5%結(jié)晶紫（Biosharp，中國(guó)）染色30 min，清水沖洗后晾干拍照。

1.8 EdU染色實(shí)驗(yàn)

處理過(guò)的EC109細(xì)胞用含EdU染色溶液（RIBOBIO，中國(guó)）的培養(yǎng)基換液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在4%多聚甲醛中固定并用0.5% TritonX-100透化。然后將細(xì)胞在1X Apollo?染色反應(yīng)液中孵育，用DAPI溶液再次染色，最后在熒光顯微鏡（Olympus，日本）下檢測(cè)。

1.9 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

處理過(guò)的EC109細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液處理細(xì)胞3～5 min，棄去胰酶，加入2 mL培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)高壓滅菌的無(wú)酶2 mL EP管中。1 000 rpm離心5 min。離心后丟棄上層培養(yǎng)基，加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，共3次。最后一次洗滌后棄去PBS，加入2 mL 70%乙醇以固定細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（凱基，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytExpert軟件進(jìn)一步分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析之前檢驗(yàn)組間變量同質(zhì)性，所有數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。兩組連續(xù)型正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組及以上連續(xù)型正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。除另外說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 ACLY在不同腫瘤中的表達(dá)

根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)33種不同腫瘤類(lèi)型的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACLY的mRNA表達(dá)水平在結(jié)腸腺癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞肝癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌以及胸腺癌等14種腫瘤中表達(dá)上調(diào)（圖1）。此外，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明ACLY在食管癌中顯著高表達(dá)（圖2）。以上結(jié)果提示了ACLY可能是不良的腫瘤相關(guān)分子。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ACLY在不同腫瘤組織中的表達(dá)Figure 1.Expression of ACLY in different tumor tissues by GEPIA database

圖2 ACLY在食管癌中的表達(dá)Figure 2.ACLY expression in esophageal cancer

2.2 ACLY在不同人種食管癌患者中的表達(dá)

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，ACLY在不同種族、性別食管癌患者腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異（圖3），提示ACLY在食管癌患者中的分布具有普遍性。

圖3 ACLY在不同人群中的表達(dá)Figure 3.ACLY expression in different groups

2.3 ACLY表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，ACLY在食管腫瘤鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4-A）。食管癌腫瘤分期I期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期腫瘤組織中ACLY表達(dá)量與正常組織相比高表達(dá)（圖4-B），腫瘤組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)N0、N1、N2和N3中ACLY表達(dá)量與正常組織相比高表達(dá)（圖4-C），提示ACLY的異常表達(dá)與食管癌的臨床表征有關(guān)。

圖4 ACLY表達(dá)與食管癌患者臨床分型的關(guān)系Figure 4.Relationship between ACLY expression and clinical classification of patients with esophageal cancer

2.4 敲低以及過(guò)表達(dá)ACLY后對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（圖5-A、6-A）與Western印跡（圖5-B、6-B）檢測(cè)結(jié)果表明，與siNC組相比，siACLY#1組、siACLY#2組ACLY的表達(dá)水平均顯著下調(diào)；與vec組相比，oeACLY組ACLY的表達(dá)水平顯著上調(diào)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在EC109細(xì)胞中siACLY#1組、siACLY#2組細(xì)胞的OD值均低于siNC組，說(shuō)明敲低ACLY后，EC109細(xì)胞的活力明顯下降（圖5-C）；在EC109細(xì)胞中oeACLY組細(xì)胞的OD值高于vec組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ACLY之后，EC109細(xì)胞的活力明顯上升（圖6-C），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。平板克隆實(shí)驗(yàn)提示，siACLY#1組、siACLY#2組的細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于siNC組，說(shuō)明敲低ACLY抑制了食管癌的增殖能力（圖5-D），而oeACLY組細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于vec組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ACLY促進(jìn)了食管癌的增殖能力（圖6-D），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EdU染色實(shí)驗(yàn)顯示，siACLY#1組、siACLY#2組中處于增殖分裂期的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例明顯低于siNC組（圖5-E），而oeACLY組中處于增殖分裂期的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例明顯高于vec組（圖6-E）。以上結(jié)果均提示ACLY可影響食管癌細(xì)胞的增殖，具體體現(xiàn)為敲低ACLY可抑制食管癌細(xì)胞的增殖，過(guò)表達(dá)ACLY可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。

圖5 ACLY敲低后對(duì)EC109細(xì)胞增殖能力的影響Figure 5.Effect of ACLY knockdown on the proliferative capacity of EC109 cells

圖6 過(guò)表達(dá)ACLY對(duì)EC109細(xì)胞增殖能力的影響Figure 6.Effect of overexpression of ACLY on the proliferative capacity of EC109 cells

2.5 敲低以及過(guò)表達(dá)ACLY后對(duì)食管癌細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，與siNC組相比，siACLY#1組、siACLY#2組G1期細(xì)胞增加，而G2和S期細(xì)胞減少（圖7-A、圖7-B）；與vec組相比，oeACLY組G1期細(xì)胞減少，而G2和S期細(xì)胞增加（圖8-A、圖8-B），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western印跡結(jié)果表明，siACLY#1組、siACLY#2組中周期調(diào)節(jié)蛋白p21、p27蛋白的表達(dá)水平均顯著高于siNC組（圖7-C），而oeACLY組中周期調(diào)節(jié)蛋白p21、p27蛋白的表達(dá)水平均顯著低于vec組（圖8-C）。以上結(jié)果表明ACLY可影響細(xì)胞周期，具體表現(xiàn)為敲低ACLY后食管癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，過(guò)表達(dá)ACLY后細(xì)胞周期得到促進(jìn)。

圖7 ACLY敲低后對(duì)EC109細(xì)胞周期的影響Figure 7.Effect of ACLY knockdown on the cell cycle of EC109 cells

圖8 過(guò)表達(dá)ACLY對(duì)EC109細(xì)胞周期的影響Figure 8.Effect of ACLY overexpression on the cell cycle of EC109 cells

3 討論

ACLY作為一種關(guān)鍵代謝酶，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮中樞作用，還可通過(guò)脂肪酸的從頭合成路徑以支持膜的生物合成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖非常重要。PI3K-Akt途徑的激活可以通過(guò)磷酸化ACLY以刺激其生物活性[11]，此外，ACLY還可以在多種位點(diǎn)被其他激酶磷酸化，例如核苷二磷酸激酶[12]和環(huán)腺苷酸依賴(lài)性蛋白激酶[13]。如前所述，ACLY在多數(shù)腫瘤中表達(dá)上升，在臨床中，ACLY在人卵巢癌中同樣高表達(dá)，可以作為預(yù)后因素。ACLY敲低可抑制細(xì)胞增殖，并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，提示ACLY可作為卵巢癌的新型治療靶點(diǎn)[14]；抑制ACLY同樣可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯[9]，此觀(guān)點(diǎn)在臨床患者標(biāo)本中得到了證實(shí)[15]，在本研究中也得到了一致的結(jié)果。有趣的是，補(bǔ)充胰島素可以挽救上述的增殖停滯；相反，脂肪酸棕櫚酸酯可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，表明ACLY的作用機(jī)制極可能與營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)[16]，這為本研究探究ACLY在食管癌中發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制提供了方向。在與ACLY相關(guān)的抗腫瘤治療方面，用特定藥物抑制ACLY不僅可以抑制對(duì)葡萄糖依賴(lài)性生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化來(lái)抑制癌癥進(jìn)展[17]。ACLY抑制劑可阻礙甲狀腺癌細(xì)胞的三維生長(zhǎng)和細(xì)胞侵襲，此外，ACLY抑制劑協(xié)同使用可以增強(qiáng)索拉非尼的細(xì)胞毒性[18]。在結(jié)直腸癌中，ACLY通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞休眠從而造成腫瘤的耐藥性甚至復(fù)發(fā)[19]；同樣地，ACLY也是前列腺癌特異性治療的可能靶點(diǎn)[20]。以上說(shuō)明了ACLY的臨床意義，ACLY分子在抗腫瘤治療中的潛力，提示其可作為食管癌治療的靶點(diǎn)。

本研究利用TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明了ACLY在結(jié)腸腺癌、腎細(xì)胞癌以及肺癌等腫瘤組織中的異常表達(dá)，這一結(jié)果與以往的研究一致。此外，數(shù)據(jù)庫(kù)分析還發(fā)現(xiàn)了ACLY在食管癌組織中也呈高表達(dá)狀態(tài)，并且ACLY在不同人群食管癌患者腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異，提示ACLY在食管癌患者中的分布具有普遍性。本研究進(jìn)一步利用細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低ACLY可抑制細(xì)胞的增殖能力且使細(xì)胞周期阻滯。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)食管癌中ACLY基因進(jìn)行分析，揭示了ACLY在食管癌中發(fā)揮的促癌作用。ACLY表達(dá)與食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系可做進(jìn)一步的研究。本研究不足之處在于并未更深一步探究ACLY與食管癌發(fā)生與發(fā)展之間的分子機(jī)制，以及沒(méi)有開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，ACLY基因表現(xiàn)出了其在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的潛在作用，預(yù)示其可能是食管癌治療與預(yù)后的潛在靶標(biāo)。