miR-222-3p對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

楊淑銀，岳二麗，郭留云，陸 珂，楊夢(mèng)宇

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙周科（鄭州 450000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生頭部或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后和生存[1-2]。因此探討OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找OSCC治療靶點(diǎn)以及改善OSCC患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA（miRNA，miR）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，可通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。近年研究顯示，miR-222-3p在宮頸癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]及甲狀腺癌[7]等多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)。已有證據(jù)顯示，miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表達(dá)，且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期密切相關(guān)。但miR-222-3p在OSCC中的作用機(jī)制尚未明確，本研究通過分析miR-222-3p對(duì)人OSCC CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，初步探討其對(duì)OSCC生物學(xué)行為的影響，為OSCC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人OSCC CAL-27細(xì)胞株及人正常口腔角質(zhì)細(xì)胞株（hNOK）均購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Trizol試劑、脂質(zhì)體lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（M-0283）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BAX（ab32503）、Bcl-2（ab32124）、MMP-2（ab92536）、N-cadherin（ab76011）、E-cadherin（ab40772）及β-actin（ab8226）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

CAL-27和hNOK細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（NC組）、inhibitor NC組和miR-222-3p inhibitor組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27細(xì)胞接種到96孔板（1×104/孔）中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右按照liporfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將miR-222-3p inhibitor和陰性對(duì)照質(zhì)粒（inhibitor NC）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

采用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用qRT-PCR儀（美國(guó)ABI）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物序列：miR-222-3p上游5'-AGCTACATCT GGCTACTGGGT-3'，下游5'-GCGAGCACAGAA TTAATACGA C-3'；U6上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算細(xì)胞中miR-222-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將CAL-27細(xì)胞接種至96孔板中，分別培養(yǎng)24，48，72和96 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清加入150 μL DMSO振蕩充分溶解，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)在570 nm處測(cè)吸光值（OD），檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

利用Annexin-V和碘化丙碇（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma-Aldrich）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將轉(zhuǎn)染48 h的CAL-27細(xì)胞消化后，重懸于結(jié)合緩沖液中，混勻后加入5 μL Annexin V（FITC），避光染色10 min后加入50 mg/L PI染色室溫避光反應(yīng)5 min，采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸浮液100 μL加入小室的上室中，將600 μL含有10% FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基或100 μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠均勻加到下室中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定遷移到下室的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈晾干后，倒置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入BAX、Bcl-2、MMP-2、N-cadherin、E-cadherin及β-actin（1 : 1 000）一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或鼠的二抗IgG（1 ∶ 2 000）。室溫孵育2 h后，暗室中用ECL發(fā)光，并采用軟件Image J進(jìn)行圖像分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-222-3p在CAL-27細(xì)胞中的表達(dá)

CAL-27細(xì)胞中miR-222-3p的表達(dá)水平顯著高于hNOK細(xì)胞（4.63±0.35vs.1.01±0.21，P＜0.001）。

2.2 各組細(xì)胞miR-222-3p的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-222-3p inhibitor組miR-222-3p的相對(duì)表達(dá)量顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05）；inhibitor NC組和NC組間miR-222-3p的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組細(xì)胞miR-222-3p的表達(dá)（n=3）Figure 1.Expression of miR-222-3p in each group(n=3)

2.3 miR-222-3p對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-222-3p inhibitor組CAL-27細(xì)胞在48，72，96 h處的增殖能力顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），而inhibitor NC組和NC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 miR-222-3p對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響（n=3）Figure 2.Effects of miR-222-3p on proliferation of CAL-27 cells (n=3)

2.4 miR-222-3p對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響

Annexin-V/PI雙染結(jié)果顯示，miR-222-3p inhibitor組的細(xì)胞凋亡率顯著高于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），而inhibitor NC組和NC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3-A。進(jìn)一步對(duì)凋亡下游標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與inhibitor NC組和NC組相比，miR-222-3p inhibitor組BAX蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；inhibitor NC組和NC組細(xì)胞中BAX和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3-B。

圖3 miR-222-3p對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響（n=3）Figure 3.Effect of miR-222-3p on apoptosis of CAL-27 cells (n=3)

2.5 miR-222-3p對(duì)CAL-27細(xì)胞侵襲的影響

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-222-3p inhibitor組細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），見圖4-A。蛋白質(zhì)印跡法分析顯示，與inhibitor NC組和NC組相比，miR-222-3p inhibitor組MMP-2和N-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），E-cadherin表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），inhibitor NC組和NC組細(xì)胞中MMP-2、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4-B。

3 討論

OSCC是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅人類的健康[8]，因此尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)OSCC的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有臨床意義。miRNA現(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其通過調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，可作為腫瘤早期診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療的靶點(diǎn)[10]。因此分析OSCC相關(guān)miRNA的作用及機(jī)制，有利于探尋新的治療靶點(diǎn)。

miR-222-3p是一類重要的miRNA，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。miR-222-3p在甲狀腺癌中高表達(dá)，其可通過靶向SLC4A4促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，有望成為甲狀腺癌患者的分子治療靶點(diǎn)[13]。miR-222-3p在宮頸癌患者血清和宮頸癌細(xì)胞系SiHa中表達(dá)上調(diào)，其通過抑制SOCS5增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞SiHa增殖、遷移和侵襲能力，可能參與宮頸癌的發(fā)病[14]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)miR-222-3p在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）感染后miR-222-3p進(jìn)一步升高；miR-222-3p通過下調(diào)THBS1調(diào)控HBV (-) HepG2細(xì)胞、HBV (+) HepG2.2.15細(xì)胞、Huh7-V細(xì)胞、Huh7-HBV細(xì)胞的增殖和凋亡，說明miR-222-3p可能是肝細(xì)胞癌和HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌潛在的診斷和治療靶點(diǎn)[15]。此外，許云等研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織中miRNA-222表達(dá)升高，且與腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為診斷和病情判斷的生物學(xué)指標(biāo)[16]。miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表達(dá)，且與pTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期密切相關(guān)[17]。然而，miR-222-3p在OSCC中的作用尚未明確。

為探討miR-222-3p在OSCC中的作用，本研究檢測(cè)了miR-222-3p在CAL-27細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-222-3p在CAL-27細(xì)胞株中高表達(dá)。為進(jìn)一步探討miR-222-3p在OSCC進(jìn)展中的功能，通過CAL-27細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-222-3p inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-222-3p inhibitor后，CAL-27細(xì)胞的凋亡率顯著升高，增殖、侵襲能力顯著降低。此外，通過分析凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-222-3p表達(dá)后，BAX、E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2、MMP-2和N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明下調(diào)miR-222-3p表達(dá)能夠抑制CAL-27細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與SCC-15和Tca-83細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[18]，說明在不同OSCC細(xì)胞系中，miR-222-3p的作用基本一致。但miR-222-3p是如何調(diào)控OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡及其在不同OSCC細(xì)胞系中的作用機(jī)制還需更深入的探討。

綜上所述，miR-222-3p在CAL-27細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-222-3p表達(dá)能抑制CAL-27細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可作為OSCC的生物治療的潛在靶標(biāo)之一。