日糧纖維水平對梅山豬血液和腸道免疫指標的影響及其機理初步解析

李平會,蒲 廣,王中宇,周五朵,3,牛培培,吳承武,侯黎明,3,黃瑞華,3*,李平華,3*

(1.南京農業大學養豬研究所(農業農村部畜禽(豬)資源評價利用重點實驗室(南京)),南京 210095;2.南京農業大學淮安研究院,淮安 223001;3.江蘇現代農業(生豬)產業技術體系集成創新中心,南京 210095)

麥麩是小麥加工制粉過程中的主要副產物[1],營養物質豐富,主要由非淀粉多糖、淀粉、蛋白質和木質素組成。2021年我國小麥年產量高達1.37億噸,麥麩產量達到2 700多萬噸[2],資源豐富。因此,麥麩在豬養殖中的合理利用對于降低養殖成本,緩解人畜爭糧問題,以及提高我國非常規飼料資源的利用率具有重要意義。膳食纖維在維持豬的消化道的正常生理功能中具有重要的作用[3],能夠改變腸道微生物群落結構[4-5],影響飼糧營養物質吸收[6],改善腸道健康[7]和調節宿主的免疫力[8]。Pu等[9]發現,在蘇淮育肥豬日糧中添加適宜的纖維提高了后腸微生物的多樣性和代謝能力。He等[10]研究表明,在日糧中補充發酵麥麩可顯著提高杜×長×大三元雜交生長育肥豬血清免疫球蛋白水平和腸道微生物的多樣性,增強機體的免疫能力。同時Luo等[11]也指出,燕麥麩對杜×長×大三元雜交生長豬的腸道健康是有益的,主要改善了結腸的腸道屏障。

梅山豬是我國太湖流域最具代表性的地方豬種,具備耐粗飼和抗逆性強的特性。許多國內外的研究[12-13]表明,與外國商品豬相比,梅山豬對許多疾病有更強的耐受性和抵抗能力。Halbur等[14]發現,與漢普夏豬和杜洛克豬相比,梅山豬更少感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒。Chen等[15]比較了梅山豬和杜×長×大三元雜交豬小腸、脾和肝等多個組織中與免疫力相關的β-防御素的表達,發現梅山豬的表達更高。Dong等[16]也發現,與雜交新生仔豬相比,梅山豬仔豬擁有更強的腸道屏障功能。前人關于日糧纖維水平對豬免疫調節的研究大多集中在外種豬,而日糧纖維對梅山豬免疫能力的影響及其相關機理的研究較少。

因此,本研究以大白豬為對照,選擇梅山豬作為試驗動物,旨在分析不同水平麩皮替代基礎日糧對梅山豬的血常規和血液生化指標、血清免疫球蛋白和腸道黏膜SIgA濃度的影響,以及日糧麩皮對梅山豬腸道基因表達和微生物群落結構的影響,研究日糧纖維對中西方豬種免疫能力的不同調節和對梅山豬免疫機制的影響,為更科學地利用我國麥麩等非常規飼料資源進行地方豬種的健康飼養提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗選取梅山豬(初始體重(67.08±1.53)kg)和與梅山豬相同生理階段的大白豬(初始體重(81.04±1.64)kg)各28頭,隨機各分成4個處理組,每組7個重復,采用自動飼喂系統奧飼本(OSB Livestock Technology Co, 111 Ltd,上海,中國)飼喂試驗豬只,每個重復1頭豬,預試期7 d,正試期28 d,結束時將試驗豬全部屠宰。預試期所有豬只飼喂相同的基礎日糧,正試期4個處理組豬分別飼喂基礎日糧(Basal)、7%麩皮替代基礎日糧(7% WBR)、10.5%麩皮替代基礎日糧(10.5% WBR)和14%麩皮替代基礎日糧(14% WBR)。目前沒有一個日糧配方能同時滿足脂肪型梅山豬和瘦肉型大白豬兩個不同類型豬種的能量需求,同時考慮到本試驗是以大白豬為對照,梅山豬為試驗豬,分析日糧纖維水平對梅山豬血液和腸道免疫指標的影響及其機理,因此決定先以滿足梅山豬需求為主,選擇豬營養需要(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長肥育豬相關標準進行基礎日糧的配制。各處理組飼糧組成除纖維水平不一致,飼糧中蛋白質、能量、鈣、磷、賴氨酸、蛋-胱氨酸均進行了調平,各項指標基本一致。同時,考慮到(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長肥育豬相關標準日糧中能量低于大白豬的需求,因此本試驗設計中所有試驗豬都自由采食,通過采食量來彌補能量不足問題。具體試驗日糧原料組成及部分營養成分見表1,飼料原料和預混料中均未添加任何抗生素產品。

表1 日糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 飼養管理

本試驗在南京農業大學淮安研究院試驗豬場進行,每欄7頭豬。試驗期間,所有試驗豬均自由采食和飲水,并按照豬場常規飼養管理程序對所有試驗豬只進行飼養管理與免疫,定時進行豬舍的消毒與清掃,保持豬舍清潔與通風。飼養過程中全部豬都處于健康狀態,沒有出現疾病和腹瀉問題。

1.3 指標測定

1.3.1 血液常規和血液生化指標測定 在正試驗期第28天經頸靜脈采集全部試驗豬的血液樣品,采集的抗凝血樣置于4℃條件下,直接送到淮安市淮陰醫院南陳集分院,使用邁瑞5300血細胞分析儀測定血液常規指標,使用貝克曼480生化分析儀測定血液生化指標;采集的不抗凝血樣室溫靜置30 min,以3 000 r·min-1離心10 min后,吸取上層血清樣品并保存在-80℃冰箱中,用于測定血清免疫球蛋白濃度。

1.3.2 血清免疫球蛋白濃度測定 上述制備的血清樣品用于測定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的含量,使用武漢華美豬免疫球蛋白酶聯免疫試劑盒進行測定,操作步驟詳見試劑盒說明書。

3）融合——融合的方向包括：通過新零售的技術手段從線上引流新會員，吸引到店消費；設立店鋪微商城，讓會員線上下單后店鋪送貨上門（主要針對店鋪半徑為3 km以內的會員）；店鋪要融合美容、化妝、美發、美甲、身體護理、保健、中醫養生等項目于一體，為消費者提供全方面的服務、返店和口碑推薦的機會；

1.3.3 盲腸和結腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)濃度測定 在正試期第28天屠宰所有試驗豬后,迅速取出腸道并剝離盲腸和結腸,無菌剪刀剪開盲腸和結腸中段,生理鹽水將內容物洗去,吸水紙吸干表面多余的水分,用無菌載玻片刮取黏膜樣品置于2 mL凍存管內,采樣結束后,將所有樣品放入-80 ℃冰箱待測。使用武漢華美豬分泌型免疫球蛋白酶聯免疫試劑盒測定盲腸和結腸黏膜樣品中SIgA的含量,操作步驟詳見試劑盒說明書。

1.3.4 梅山豬結腸黏膜的轉錄組測序(RNA-seq) 按照Yeasen的RNA提取試劑盒(MolPure?Cell/Tissue Total RNA Kit)說明書中的步驟提取梅山豬結腸黏膜RNA樣品,并送至武漢華大基因進行RNA-seq測序,測序流程包括RNA樣品質檢、文庫建立、Illumina Hiseq 2500測序平臺對樣品進行雙末端測序得到raw reads、利用Fastqc軟件進行數據質控及過濾、最終獲得clean reads。

1.3.5 梅山豬結腸內容物的宏基因組測序 梅山豬屠宰后,迅速剝離結腸及采樣部位的腸系膜,用無菌剪刀在腸壁上剪個小孔,將內容物擠到2 mL的無菌凍存管中并放入-80 ℃冰箱保存。按照Omega Bio-Tek的DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Stool DNA Kit)說明書中的步驟提取梅山豬結腸內容物的DNA樣品,并送至上海美吉生物進行宏基因組測序,測序流程包括DNA質檢、超聲波破碎儀Covaris M220將DNA片段化、使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit構建PE文庫、使用軟件Seqprep(https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep)、Sickle(https:∥github.com/najoshi/sickle)和BWA(http:∥bio-bwa.sourceforge.net)進行數據質控、使用軟件MEGAHIT(https:∥github.com/voutcn/megahit)進行拼接組裝、使用MetaGene(http:∥metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)進行基因預測、使用軟件CD-HIT(http:∥www.bioinformatics.org/cd-hit/)構建非冗余基因集、使用軟件SOAPaligner(http:∥soap.genomics.org.cn/)進行基因豐度計算。

1.4 數據分析

通過Excel 2019軟件初步整理試驗數據,利用SPSS 26.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)分析不同日糧麩皮替代水平對各指標的線性和二次方的影響;利用SPSS 26.0軟件中的一般線性模型分析品種和日糧的交互作用對各指標的影響;利用R包DESeq2通過FPKM方法對基因表達量進行標準化,并分析差異表達基因(p-adjust value<0.05; |log2 (fold change)|>1);使用在線數據庫KOBAS(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn)對差異基因進行GO和KEGG功能富集;利用上海美吉生物云平臺(https:∥cloud.majorbio.com)分析宏基因組測序數據和進行相關性分析。統計分析結果以“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。若P<0.05表示差異顯著,若P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬血液常規和血液生化的影響

由表2和3可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的嗜酸性粒細胞數、嗜酸性粒細胞百分比和嗜堿性粒細胞數呈線性降低(P<0.05),血清球蛋白呈二次方變化(P<0.05);豬品種和日糧的交互作用對嗜酸性粒細胞數、嗜酸性粒細胞百分比、平均紅細胞血紅蛋白含量、紅細胞分布寬度標準差及血清球蛋白產生顯著的影響(P<0.05);值得注意的是,進一步比較兩品種豬的血清球蛋白濃度發現(圖1),梅山豬和大白豬的Basal組、7%和10.5% WBR組的血清球蛋白濃度差異不顯著(P>0.05),但14% WBR組梅山豬的血清球蛋白濃度顯著高于大白豬(P<0.05)。

MS.梅山豬; LW.大白豬.*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同MS. Meishan pigs; LW. Large white pigs. * means significant difference (P<0.05),** means extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖1 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬血清球蛋白水平的影響Fig.1 Effects of different dietary wheat bran replacement levels on serum globulin level in Meishan pigs and Large White pigs

表3 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬血生化指標的影響

2.2 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬血清免疫球蛋白的影響

由表4可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的血清IgA呈二次方變化,血清IgM和IgG呈線性升高(P<0.01);大白豬血清IgM呈線性和二次方變化(P<0.01);豬品種和日糧的交互作用對血清IgA和IgG產生顯著的影響(P<0.05)。由圖2可知,14% WBR組梅山豬的血清IgG的濃度顯著高于大白豬(P<0.01)。

2.3 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬大腸黏膜SIgA的影響

由表5可知,隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的結腸黏膜SIgA濃度極顯著升高(P<0.01),且14% WBR組梅山豬的結腸黏膜SIgA濃度極顯著高于Basal組和7% WBR組(P<0.01),大白豬的結腸黏膜SIgA濃度呈線性變化(P<0.05);梅山豬和大白豬的盲腸黏膜SIgA濃度不受日糧麩皮替代水平的影響。

表5 不同日糧麩皮替代水平對梅山豬和大白豬結腸和盲腸黏膜SIgA濃度的影響

2.4 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜RNA-seq分析

2.4.1 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜RNA-seq質量分析 提取Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜RNA進行RNA-seq測序,測序完成后將原始數據進行數據過濾,每個樣品得到超過6 G的clean date。測序結果見表6,Q20數據全部在96%以上,表明測序深度能滿足后續分析。

表6 Basal組和14% WBR組梅山豬結腸黏膜轉錄組測序質量匯總

2.4.2 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜RNA-seq差異基因分析和PCA聚類 利用R軟件包DESeq2進行差異分析,Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜共鑒別到26 208個基因,其中38個基因在兩組間差異表達,共包括7個下調基因和31個上調基因見圖3A。根據各樣品所有基因的FPKM值進行PCA主成分分析,Basal組和14% WBR組的組內樣品較好的聚在一起,組間樣品出現明顯的分離見圖3B,表明分組具有意義。

圖3 Basal組和14% WBR組梅山豬結腸黏膜差異表達基因火山圖(A)和PCA聚類分析(B)Fig.3 Basal group and 14% WBR group Meishan pigs colonic mucosal differentially expressed genes volcano map (A) and PCA cluster analysis (B)

2.4.3 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸黏膜RNA-seq差異基因功能富集 使用在線數據庫KOBAS對38個差異表達基因進行GO和KEGG富集分析,GO富集分析選取細胞組分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)和生物過程(Biological process,BP)三個功能層面顯著富集的前15個功能條目做氣泡圖展示,見圖4。在GO富集分析中,CC層面顯著富集到的功能條目是刷狀緣膜(brush border membrane)、細胞外泌體(extracellular exosome)、膜筏(membrane raft)、含膠原蛋白的細胞外基質(collagen-containing extracellular matrix)、受體復合體(receptor complex)及頂端質膜(apical plasma membrane)等;MF層面顯著富集到的功能條目是蛋白質同二聚化活性(protein homodimerization activity)、層黏連蛋白結合(laminin binding)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)及血紅素結合(heme binding)等;BP層面顯著富集到的功能條目是氧化還原過程(oxidation-reduction process)、細胞群增殖的調節(regulation of cell population proliferation)、免疫反應(immune response)、將螯合的鈣離子釋放到細胞質中(release of sequestered calcium ion into cytosol)及趨化因子介導的信號通路(chemokine-mediated signaling pathway)等。

在KEGG富集分析中,17條代謝通路被顯著富集見圖5,其中細胞因子與細胞因子受體相互作用信號通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用信號通路(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、原發性免疫缺陷信號通路(Primary immunodeficiency)及IgA產生的腸道免疫網絡信號通路(Intestinal immune network for IgA production)是與免疫調節相關的代謝通路。結合結腸黏膜SIgA濃度變化和KEGG富集的信號通路,最終篩選出調控SIgA產生的2個候選差異基因CD4分子(CD4)和CC趨化因子受體9(CCR9),CCR9參與IgA產生的腸道免疫網絡信號通路。與Basal組相比,14% WBR組顯著提高了梅山豬結腸黏膜CD4和CCR9基因的表達,見圖6。

圖6 Basal組和14% WBR組梅山豬結腸黏膜CD4和CCR9基因表達量Fig.6 Expression of CD4 and CCR9 genes in the colonic mucosa of Meishan pigs in the Basal group and 14% WBR group

2.5 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸內容物宏基因組分析

2.5.1 Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物組成結構 使用群落柱形圖能夠直觀地展示Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物群落組成。Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物結構見圖7A,在門水平上,厚壁菌門(Firmicutes,相對豐度>43%)和擬桿菌門(Bacteroidetes,相對豐度>37%)是相對豐度最高的兩個菌門,相對豐度之和大于80%,表明梅山豬結腸中的大部分微生物屬于厚壁菌門和擬桿菌門;在屬水平見圖7B,優勢菌屬為Prevotella、unclassified_o_Clostridiales、Clostridium、Treponema、Bacteroides、unclassified_f_Lachnospiraceae、unclassified_p_Firmicutes、unclassified_o_Bacteroidales和Lactobacillus。

2.5.2 利用LEFSe分析和相關性熱圖篩選顯著影響梅山豬免疫調節的微生物 為了找到顯著影響梅山豬免疫調節的微生物,對Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物進行LEFSe分析。結果見圖8,在14% WBR組顯著富集5個種水平微生物(Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762、Nitrospirasp.和Desulfurellalesbacterium),1個屬水平微生物(unclassified_o_Desulfurellales),2個科水平微生物(Azonexaceae和unclassified_o_Desulfurellales)及1個綱水平微生物(Rhodocyclales)。為了探究腸道微生物與宿主結腸黏膜基因的互作,對體液免疫和結腸黏膜SIgA的影響,將5個種水平微生物與調控SIgA產生的2個候選結腸黏膜差異表達基因(CD4和CCR9)、血清免疫球蛋白和結腸黏膜SIgA做相關性分析,結果見圖9,種水平微生物和調控SIgA產生的2個候選宿主結腸黏膜基因不存在直接互作關系(P>0.05),但Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.與血清IgG呈顯著正相關,Clostridiumsp.CAG:138和Nitrospirasp.與結腸黏膜SIgA呈顯著正相關,該結果表明日糧纖維引起的腸道微生物變化不直接調控影響SIgA產生的宿主腸道基因的改變,可能通過微生物代謝產物影響機體免疫。

圖8 LEfSe分析Basal組和14% WBR組梅山豬結腸顯著富集的微生物Fig.8 LEfSe analysis of significantly enriched microorganisms in the colon of Meishan Pigs in the Basal group and 14% WBR group

圖9 14% WBR組顯著富集的種水平微生物與宿主結腸黏膜基因、血清免疫球蛋白及SIgA的相關性分析Fig.9 Analysis of correlation between significantly enriched microorganisms in the 14% WBR group at the species level and host colonic mucosal gene, serum immunoglobulin, and SIgA

2.5.3 KEGG注釋揭示梅山豬Basal組和14% WBR組之間與免疫調節相關代謝通路的差異 為研究Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物變化所產生的不同功能,將宏基因組數據與KEGG數據庫進行注釋,圖10發現14% WBR組IgA產生的腸道免疫網絡功能通路(intestinal immune network for IgA production)的相對豐度顯著高于Basal組(P<0.05)。該結果表明14%麩皮替代基礎日糧飼喂梅山豬引起改變的結腸微生物,具有增強結腸產生IgA的功能。

圖10 Wilcoxon秩和檢驗分析Basal組和14% WBR組KEGG代謝通路的差異Fig.10 Difference of KEGG metabolic pathway between Basal group and 14% WBR group analyzed by Wilcoxon rank sum test

3 討 論

在開展中、西方豬對比試驗中,目前沒有一個日糧配方能同時滿足脂肪型梅山豬和瘦肉型大白豬兩個不同類型豬種的能量需求。考慮到本研究是以梅山豬為試驗豬,分析日糧纖維水平對梅山豬血液和腸道免疫指標的影響及其機理,大白豬作為對照組,因此試驗設計以滿足梅山豬能量需求為主,按豬營養需要(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長肥育豬相關標準進行基礎日糧的配制。同時,考慮到(GB/T 39235—2020)中脂肪型生長肥育豬相關標準日糧中能量低于大白豬的需求,試驗中安排豬自由采食,通過采食量來彌補能量不足問題。Hakansson等[17]和Ramaekers等[18]的研究中發現,自由采食的飼喂方式能讓動物通過采食量補充能量攝入。最后,本試驗期間大白豬的生長性能正常,基礎日糧下,大白豬的日增重是826.44 g·d-1,采食量是3.05 kg·d-1(數據來自本團隊另外一篇投稿文章,尚未發表),與文獻報道的數據接近[19-21],綜合反映了通過自由采食可以彌補大白豬能值攝入不足的問題,也間接證明了本試驗設計的合理性。

血常規和血生化指標在很大程度上反映動物機體的健康狀況[22]。本試驗中,梅山豬和大白豬的血常規和血生化的所有指標都在正常范圍內,同時,在飼養過程中所有豬只均無腹瀉和明顯異常,表明全部試驗豬總體處于健康狀態。嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞是在骨髓中發育成熟,都屬于白細胞的組成部分,它們在血液中的數量變化可以反映機體的炎癥狀態[23]。研究發現,機體嗜酸性粒細胞數的升高與過敏和傳染病等疾病相關,且與疾病的嚴重程度呈正相關[24]。也有研究表明,嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞主要在發生炎癥的器官和組織內被招募,同時被激活釋放大量的炎癥介質[25]。本研究發現,隨日糧中麩皮替代比例的增加降低了梅山豬血液中嗜酸性粒細胞數、嗜酸性粒細胞百分比和嗜堿性粒細胞數,該結果表明日糧中添加麩皮降低了梅山豬機體的炎癥水平。

血清球蛋白是機體除血清白蛋白外所有蛋白質的總稱,血清球蛋白水平升高的主要原因是血清免疫球蛋白水平的升高[26]。本研究比較了梅山豬和大白豬的血清球蛋白濃度,發現Basal組、7%和10.5% WBR組沒有顯著差異,但14% WBR組梅山豬的血清球蛋白顯著高于大白豬。為研究14%的麩皮替代基礎日糧是否增加梅山豬的血清免疫球蛋白水平,本研究測定了梅山豬血清中免疫球蛋白的濃度。血清免疫球蛋白是體液免疫的主要組成部分,是反映機體免疫功能的重要指標,包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE[27]。IgG是血清抗體的主要組成部分,是機體抗感染的“主力軍”,參與各項免疫防御機制;IgA的含量僅次于IgG,主要發揮局部免疫作用;IgM是機體最早合成和分泌的抗體,也是機體初次應答最早出現的抗體[28-29]。He等[10]研究表明,在日糧中補充發酵麥麩可顯著提高生長育肥豬血清IgM和IgG的水平。Shang等[30]也報道基礎日糧中添加麥麩顯著增加了豬血清中IgG、IgA和IgM的濃度。本研究發現隨日糧麩皮替代水平的升高,梅山豬的血清IgM和IgG以及大白豬的血清IgM濃度顯著增加,與前人的研究結果類似。本研究進一步比較了梅山豬和大白豬品種間的血清IgG濃度,發現14% WBR組梅山豬顯著高于大白豬,該結果表明麥麩替代部分基礎日糧改善了梅山豬和大白豬的體液免疫,且日糧麩皮對梅山豬免疫力的增強優于大白豬。

單胃動物的大腸是消化纖維的主要場所[31],因此后腸的健康對動物的生長性能和整體健康至關重要[32]。腸道黏膜由腸上皮、腸相關淋巴組織和覆蓋在上皮的黏液組成,在維持腸道屏障保護中起重要作用[33]。IgA是黏膜免疫系統中含量最多的抗體,是組成SIgA的二聚體IgA的單體,絕大多數SIgA由腸道產生,并在原位產生效應[34]。SIgA類抗體構成了抗原特異性免疫防御的第一道防線,能維持腸道共生微生物之間的平衡,防止黏膜表面的病原體進入機體及促進腸道內穩態[34-35]。在本試驗中,14%的麩皮顯著增加了梅山豬結腸黏膜的SIgA濃度,大白豬的沒有顯著變化,表明14%的麩皮日糧增強了梅山豬結腸的黏膜免疫力。Dong等[16]報道與外種豬相比,梅山豬擁有更強的腸道屏障功能,這可能是梅山豬能在短時間內提高腸道免疫系統適應日糧中纖維增加的原因。為了探究日糧纖維對梅山豬結腸黏膜免疫的影響,本研究利用轉錄組和宏基因組測序技術從宿主結腸黏膜基因和腸道微生物兩個層面進行機制解析。通過轉錄組測序在梅山豬Basal組和14% WBR組鑒別到38個結腸黏膜差異表達基因,對這38個差異表達基因進行GO和KEGG功能富集。在GO的三個功能層面富集中,細胞組分(CC)和生物過程(BP)富集的功能條目最多,主要與細胞信號轉導(細胞外泌體(extracellular exosome))、細胞增殖(細胞群增殖的調節(regulation of cell population proliferation))和免疫系統(免疫反應(immune response))等相關,表明麩皮主要通過調控梅山豬腸上皮細胞的增殖影響腸道免疫。在KEGG富集中,顯著富集到5條與免疫調節相關的代謝通路:細胞因子與細胞因子受體相互作用信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用信號通路、趨化因子信號通路、原發性免疫缺陷信號通路及IgA產生的腸道免疫網絡信號通路,該結果進一步證明麩皮對梅山豬結腸黏膜免疫系統的調節作用。其中,IgA產生的腸道免疫網絡信號通路是參與調控SIgA產生的通路。CCR9是腸道黏膜趨化因子受體,對于腸道黏膜免疫的發展和維持有重要作用[36],并且參與刺激“IgA產生的腸道免疫網絡信號”通路中IgA+B細胞的腸道歸巢,IgA+B細胞最終在腸道固有層分化形成能產生IgA的漿細胞[37]。CD4分子是主要表達于T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白[38],在免疫應答中具有增強T淋巴細胞與靶細胞結合、促進T細胞激活啟動免疫應答和作為T淋巴細胞表面的標記性糖蛋白輔助產生記憶細胞的功能[39-40]。本研究中,14%的麩皮顯著上調了梅山豬結腸黏膜與免疫調節相關的基因CD4和CCR9的表達,該結果暗示14%的麩皮改善了梅山豬結腸的黏膜免疫,并且通過上調參與“IgA產生的腸道免疫網絡信號通路”中的CCR9基因,產生更高水平的SIgA,增強了結腸黏膜免疫屏障,促進腸道健康。

宿主免疫系統和腸道微生物之間的相互作用非常重要,宿主免疫系統可以調節腸道微生物的結構和組成[41],同時腸道微生物也能影響黏膜免疫系統的發育和功能[42]。本研究中發現梅山豬結腸微生物相對豐度最高的兩個門水平微生物是Firmicutes和Bacteroidetes,與Xu等[43]在梅山后備母豬和Jiang等[44]在梅山斷奶仔豬中的研究一致。Firmicutes和Bacteroidetes代表了健康胃腸道中的兩個主要門[45-46],在腸道微生物發酵和維持微生態平衡中起著重要作用。在屬水平,梅山豬結腸的優勢菌屬為Prevotella、unclassified_o_Clostridiales、Clostridium和Treponema等,與前人的研究基本一致[43]。Basal組和14% WBR組梅山豬的結腸微生物進行LEFSe分析,Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762、Nitrospirasp.和Desulfurellalesbacterium5個種水平微生物在14% WBR組顯著富集。其中Sutterellasp.是革蘭陰性菌,具有調節黏膜代謝和腸道上皮完整性的功能,并且能起到免疫調節的作用[47]。Clostridium是革蘭陽性厭氧菌,具有多種代謝功能,包括將淀粉、蛋白質和嘌呤轉化為乙酸、丁酸和乳酸等對機體健康有益的有機酸[48]。研究發現,腸腔中的Clostridium能通過誘導結腸黏膜的調節性T Cell維持免疫穩態,屬于Clostridium的簇IV和XIVa也與維持黏膜穩態和預防炎癥性腸病相關[49]。Clostridiumsp.CAG:138和Clostridiumsp.CAG:762都屬于Clostridium,但這兩個菌株的功能還沒有明確的報道。Nitrospirasp.屬于Nitrospira,后者通常作為硝化細菌,發揮的主要作用是參與氮循環及將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽,主要在污水處理[50]和生態系統[51]中研究較多,與免疫功能相關的研究鮮有報道。種水平差異微生物和篩選出的調控SIgA產生的2個候選宿主結腸黏膜差異表達基因(CD4和CCR9)的互作分析發現腸道微生物和調控SIgA產生的宿主結腸黏膜基因之間不存在直接互作關系,但Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.與血清IgG呈顯著正相關,Clostridiumsp.CAG:138和Nitrospirasp.與結腸黏膜SIgA呈顯著正相關。同時KEGG功能注釋結果發現14% WBR組IgA產生的腸道免疫網絡功能通路的相對豐度顯著高于Basal組。該結果表明,14%的麩皮優化了梅山豬的結腸菌群結構,增強微生物產生IgA的功能,促進結腸健康。

4 結 論

4.1日糧中添加麩皮可以降低梅山豬機體的炎癥水平和增強體液免疫,并且添加14%的麩皮對梅山豬的促進效果優于大白豬。

4.2日糧中添加14%的麩皮上調了調控SIgA產生的2個候選結腸黏膜基因CD4和CCR9的表達,增強梅山豬IgA產生的腸道免疫網絡功能通路,提高腸腔SIgA的水平,有助于改善腸道屏障功能,促進機體健康。

4.3日糧中添加14%的麩皮優化了梅山豬的腸道菌群結構,Sutterellasp.、Clostridiumsp.CAG:138、Clostridiumsp.CAG:762和Nitrospirasp.可能是增強梅山豬免疫功能的重要菌株。