我國耐除草劑棉花研發與育種應用

梁成真，金雙俠

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我國耐除草劑棉花研發與育種應用

梁成真1，金雙俠2

1中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081；2華中農業大學植物科學技術學院/作物遺傳改良全國重點實驗室，武漢 430070

棉花是世界上最主要的天然纖維來源，也是重要的油料和飼料兼用作物，在國民經濟中具有重要的戰略地位[1-3]。經過近30年的努力，我國基本解決了棉鈴蟲危害，棉花單產居世界前列，優質進程也明顯加快[4]。近年來，草害上升為我國棉花生產的主要危害之一。棉田雜草不僅競爭水分、養分和光照，而且滋生病害和蟲害，嚴重影響棉纖維的產量和品質，給棉花生產帶來極大危害[5-6]，成為亟待解決的產業問題。1996年全世界第一例轉基因耐除草劑大豆GTS40-3-2商業化以來，耐除草劑作物在玉米、大豆和棉花等作物中得到廣泛的應用[7]。目前，具有耐除草劑性狀作物占全球轉基因作物種植面積的80%左右[7-9]。美國率先通過導入用根癌農桿菌（sp. CP4）5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）編碼基因獲得耐草甘膦除草劑棉花，并于1997年商業化種植。由于其顯著的經濟、社會和生態效益，耐除草劑棉花全美種植面積占比從1997年的3.2%增加到2005年的60%，目前穩定在90%左右[7-9]。近年來，我國在耐除草劑新基因克隆和耐除草劑棉花種質創制等方面都取得顯著的進展，且部分耐除草劑種質已進入農業轉基因生物安全性評價流程[10]，但是，我國自主知識產權的耐除草劑棉花產業化應用仍然滯后。本專題展示了我國耐除草劑棉花創制和轉基因安全性評價的研究進展，以期加快國產耐除草棉花的育種應用，為培育高產優質高抗棉花新品種提供種質資源和應用指導。

農桿菌介導法是棉花廣泛應用的遺傳轉化方法，具有效率高、拷貝數低、穩定性好等優點[11]。然而，利用農桿菌介導遺傳轉化法進行基因操作時，T-DNA整合到植物染色體的位置具有隨機性，可能會導致外源或內源基因表達的沉默或功能缺失[12]。陸地棉占棉花總產的95%以上，但由于其基因組是復雜的異源四倍體，基因組較大且含有高比例的重復序列[1-3]，棉花遺傳轉化中T-DNA序列整合位點以及邊界序列的狀態尚難以精準的控制。因此，對比研究轉基因作物不同世代的外源基因DNA整合、基因表達、蛋白表達、目的性狀及農藝性狀等遺傳穩定性，是轉基因作物商業化應用的前提[13]。本專題論文《耐除草劑棉花GGK2的遺傳穩定性分析及性狀鑒定》[14]對連續3代轉基因棉花GGK2的檢測結果顯示，外源目的基因穩定的整合到棉花基因組中，目的基因、和篩選標記基因的拷貝數、蛋白表達量、草甘膦耐受性以及農藝性狀等在不同代際間均無顯著差異，并且轉基因棉花GGK2能夠耐受田間使用中劑量4倍的草甘膦濃度，農藝性狀和營養品質與對照組相比無顯著差異，達到了生產用耐除草劑棉花對草甘膦除草劑的耐受水平。未來，與生產中廣泛應用的國產抗蟲棉品種雜交，可獲得同時抗棉鈴蟲和耐除草劑的棉花新品種。總之，轉基因棉花GGK2是高耐除草劑且穩定遺傳的轉基因材料，目前已經進入轉基因安全性評價生產應用證書申報階段，具有廣闊的產業化應用前景。

草甘膦除草劑自1974年商業化以來，成為世界上用量增長最快、生產量最大的農藥，目前年用量100萬t左右，占全世界除草劑市場份額的30%以上[7-10]。近年來，除了之外，從抗草甘膦的微生物中分離鑒定到數個類基因并應用于耐除草劑作物的培育，如[15]、[16]、[6]、[10]等。盡管都屬于EPSPS類蛋白，但是它們和CP4 EPSPS序列相似性相對較低，因此，能夠獲得專利權，為培育具有自主知識產權的耐除草劑作物提供了基因基礎。本專題論文《轉+耐草甘膦優異棉花種質系的創制及其特性》[17]利用耐輻射奇球菌（）EPSPS基因轉化中棉所49，獲得3個穩定遺傳的單拷貝整合的轉化體ZD131、ZD185和ZD207，T-DNA插入位點分別在D7、D13和A12染色體。3個轉基因株系均耐受4倍田間草甘膦推薦劑量且生長發育正常。有意思的是，轉基因株系棉鈴大小、衣分、結鈴性等產量性狀和纖維品質均優于對照組，說明其具有較好的應用潛力。本專題另外一篇論文《轉基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鑒定》[18]利用農桿菌介導法轉化基因，獲得穩定遺傳的耐草甘膦除草劑棉花R1-3。同樣，R1-3棉花中T-DNA為單拷貝插入，整合位點在A11或D11染色體基因間隔區，未破壞受體棉花的內源基因，也未發現對插入位點附近基因表達的影響。ZD系列和R1-3等耐除草劑棉花的創制，豐富了我國自主知識產權耐除草劑棉花種質資源的儲備，與GGK2棉花共同形成了國產耐除草劑棉花產業應用的梯隊系列產品，為保障我國耐除草劑棉花穩定健康發展奠定了資源基礎。

盡管草甘膦是全球第一大除草劑品種，但是長期大面積使用單一類型的除草劑，容易導致雜草抗藥性、基因逃逸、藥害殘留等問題[19]。研發安全高效且環境友好的新型除草劑，培育與之相匹配的抗性作物是未來解決草害問題的發展方向。近年來，功能基因組學、代謝組學、蛋白質組學等多組學的快速發展為解決雜草危害提供了新的切入點。同時，農業生物技術的快速發展，尤其是基因編輯技術在棉花中的廣泛應用[19-28]，為培育新型耐除草劑棉花提供了新策略。本專題論文《后基因組時代發展抗除草劑作物的機遇及挑戰》[29]從3個層面系統綜述了耐除草劑作物的發展，一是除草劑靶標基因與作用機制研究層面，系統總結了幾種不同作用機制的除草劑靶標基因，比如植物氨基酸生物合成、植物脂類代謝、植物類胡蘿卜素、質體醌和生育酚生物合成途徑的研究進展。二是新型耐除草劑基因挖掘與除草劑系統層面，重點介紹了2種挖掘新型抗除草劑基因與除草劑系統的方法，包括基于CRISPR/Cas系統對作物內源除草劑靶標基因進行定向突變、定向激活法和天然產物與生物體存在共同進化理論的抗性基因導向法。三是耐除草劑作物培育層面，系統總結了3種培育抗除草劑作物方法，包括常規育種培育法、轉基因育種培育法和基于CRISPR/Cas基因組編輯技術培育法，并且重點介紹了CIRSPR/ Cas系統、堿基編輯技術和Prime-editing系統在培育抗除草劑作物中的研究進展。在后基因組時代，針對雜草防治中抗性雜草發生、環境安全和基因逃逸等挑戰，基因組編輯技術的快速發展為雜草防治提供了新策略和機遇。

[1] Wen X P, Chen Z W, Yang Z R, Wang M J, Jin S X, Wang G D, Zhang L, Wang L J, Li J Y, Saeed S, He S P, Wang Z, Wang K, Kong Z S, Li F G, Zhang X L, Chen X Y, Zhu Y X. A comprehensive overview of cotton genomics, biotechnology and molecular biological studies. Science China Life Sciences, 2023: 1-43.

[2] YANG Z R, QANMBER G, WANG Z, YANG Z E, LI F G. Gossypium genomics: Trends, scope, and utilization for cotton improvement. Trends in Plant Science, 2020, 25(5): 488-500.

[3] HUANG G, HUANG J Q, CHEN X Y, ZHU Y X. Recent advances and future perspectives in cotton research. Annual Review of Plant Biology, 2021, 72: 437-462.

[4] 郭三堆, 王遠, 孫國清, 金石橋, 周燾, 孟志剛, 張銳. 中國轉基因棉花研發應用二十年. 中國農業科學, 2015, 48(17): 3372-3387.

GUO S D, WANG Y, SUN G Q, JIN S Q, ZHOU T, MENG Z G, ZHANG R. Twenty years of research and application of transgenic cotton in China. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(17): 3372-3387. (in Chinese)

[5] 蔡曉虎, 林萍, 史亞輝, 韓睿, 張玉棟, 吳娜, 王俊剛. 扁稈荊三棱種群密度對棉花營養物質吸收和積累的影響. 棉花學報, 2020, 32(2): 143-150.

CAI X H, LIN P, SHI Y H, HAN R, ZHANG Y D, WU N, WANG J G. Effects of population density ofon the absorption and accumulation of cotton nutrients. Cotton Science, 2020, 32(2): 143-150. (in Chinese)

[6] 王霞, 馬燕斌, 吳霞, 沈志成, 林朝陽, 李朋波, 孫璇, 王新勝, 李燕娥, 李貴全. 轉棉花株系的獲得及分子生物學鑒定. 中國農業科學, 2014, 47(6): 1051-1057.

WANG X, MA Y B, WU X, SHEN Z C, LIN C Y, LI P B, SUN X, WANG X S, LI Y E, LI G Q. Molecular biology identification of transgenic cotton lines expressing exogenousgene. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(6): 1051-1057. (in Chinese)

[7] DUKE S O, POWLES S B. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Management Science, 2008, 64(4): 319-325.

[8] Bonny S. Genetically modified herbicide-tolerant crops, weeds, and herbicides: Overview and impact. Environmental Management, 2016, 57(1): 31-48.

[9] DUKE S O, POWLES S B. Glyphosate-resistant weeds and crops. Pest Management Science, 2008, 64(4): 317-318.

[10] LIANG C Z, SUN B, MENG Z G, MENG Z H, WANG Y, SUN G Q, ZHU T, LU W, ZHANG W, MALIK W, LIN M, ZHANG R, GUO S D. Co-expression ofandyields herbicide-resistant cotton with low glyphosate residues. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(12): 1622-1629.

[11] SHILO S, TRIPATHI P, MELAMED-BESSUDO C, TZFADIA O, MUTH T R, LEVY A A. T-DNA-genome junctions form early after infection and are influenced by the chromatin state of the host genome. PLoS Genetics, 2017, 13(7): e1006875.

[12] DONG O X, RONALD P C. Targeted DNA insertion in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2021, 118(22): e2004834117.

[13] 李圣彥, 李香銀, 李鵬程, 張明俊, 張杰, 郎志宏. 轉基因玉米2HVB5的性狀鑒定及遺傳穩定性分析. 生物技術通報, 2023, 39(1): 21-30.

LI S Y, LI X Y, LI P C, ZHANG M J, ZHANG J, LANG Z H. Identification of target traits and genetic stability of transgenic maize 2HVB5. Biotechnology Bulletin, 2023, 39(1): 21-30. (in Chinese)

[14] 梁成真, 臧有義, 孟志剛, 王遠, Mubashir Abbas, 何海焱, 周琪, 魏云曉, 張銳, 郭三堆. 耐除草劑棉花GGK2的遺傳穩定性分析及性狀鑒定. 中國農業科學, 2023, 56(17): 3251-3260.

LIANG C Z, ZANG Y Y, MENG Z G, WANG Y, MUBASHIR A, HE H Y, ZHOU Q, WEI Y X, ZHANG R, GUO S D. Identification of target traits and genetic stability of transgenic cotton GGK2. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3251-3260. (in Chinese)

[15] GUO B F, GUO Y, HONG H L, JIN L G, ZHANG L J, CHANG R Z, LU W, LIN M, QIU L J. Co-expression ofand glyphosate acetyltransferasegenes conferring high tolerance to glyphosate in soybean. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 847.

[16] 梅磊, 陳進紅, 何秋伶, 祝水金. 草甘膦對轉基因棉花種質系配子育性的影響. 棉花學報, 2013, 25(2): 115-120.

MEI L, Chen J H, He Q L, Zhu S J. Effect of glyphosate on the gamete fertility of transgenic glyphosate-resistant cotton germplasms with EPSPS-G6. Cotton Science, 2013, 25(2): 115-120.

[17] 王宛如, 曹躍芬, 盛況, 陳進紅, 趙天倫, 祝水金. 轉+耐草甘膦優異棉花種質系的創制及其特性. 中國農業科學, 2023, 56(17): 3261-3276.

WANG W R, CAO Y F, SHENG K, CHEN J H, ZHAO T L, ZHU S J. The creation and characteristics of cotton germplasm lines transgenic+gene with excellent glyphosate tolerance. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3261-3276. (in Chinese)

[18] 馬燕斌, 李換麗, 文晉, 周仙婷, 秦欣, 王霞, 王新勝, 李燕娥. 轉基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鑒定. 中國農業科學, 2023, 56(17): 3277-3284.

MA Y B, LI H L, WEN J, ZHOU X T, QIN X, WANG X, WANG X S, LI Y E. Identification of molecular characterizations for transgenic cotton R1-3 line of glyphosate tolerance. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3277-3284. (in Chinese)

[19] Li J Y, Manghwar H, Sun L, Wang P C, Wang G Y, Sheng H Y, Zhang J, Liu H, Qin L, Rui H P, Li B, Lindsey K, Daniell H, Jin S X, Zhang X L. Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants.Plant Biotechnology Journal,2019, 17(5): 858-868.

[20] YU L, Li Z S, DING X, ALARIQI M, ZHANG C J, Zhu X Q, Fan S L, Zhu L F, ZHANG X L, JIN S X. Developing an efficient CRISPR/dCas9-TV-derived transcriptional activation system to create three novel cotton germplasm materials. Plant Communications, 2023, 4(4): 100600.

[21] Wang G Y, Xu Z P, Wang F Q, Huang Y F, Xin Y F, Liang S J, Li B, Si H, Sun L, Wang Q Q, Ding X, Zhu X Q, Chen L, Yu L, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. Development of an efficient and precise adenine base editor (ABE) with expanded target range in allotetraploid cotton (). BMC Biology, 2022, 20(1): 45.

[22] Li B, Liang S J, Alariqi M, Wang F Q, Wang G Y, Wang Q Q, Xu Z P, Yu L, Zafar M N, Sun L, Si H, Yuan D J, Guo W F, Wang Y Q, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. The application of temperature sensitivity CRISPR/LbCpf1 (LbCas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton () and creation of nontransgenic, gossypol-free cotton. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(2): 221-223.

[23] Chen Y Z, Fu M C, Li H, Wang L G, Liu R Z, Liu Z J, Zhang X L, Jin S X. High-oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton (L.) generated by knockout ofgenes with CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(3): 424-426.

[24] Wang Q Q, Alariqi M, Wang F Q, Li B, Ding X, Rui H P, Li Y J, Li J Y, Xu Z P, Qin L, Sun L, Li J Y, Zou J W, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. The application of a heat-inducible CRISPR/Cas12b (C2c1) genome editing system in tetraploid cotton () plants. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(12): 2436-2443.

[25] Manghwar H, Li B, Zhang X L, Jin S X. Strategies to overcome off-target effects by CRISPR/Cas system (2020). Advanced Science, 2020, 7(6): 1902312.

[26] Qin L, Li J Y, Wang Q Q, Xu Z P, Sun L, Alariqi M, Manghwar H, Wang G Y, Li B, Ding X, Rui H P, Huang H M, Lu T L, Lindsey K, Daniell D, Zhang X L, Jin S X. High efficient and precise base editing of C?G to T?A in the allotetraploid cotton () genome using a modified CRISPR/Cas9 system.Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(1): 45-56.

[27] Li B, Rui H P, Li Y J, Wang Q Q, Alariqi M, Qin L, Sun L, Ding X, Wang F Q, Zou J W, Wang Y Q, Yuan D J, Zhang X L, Jin S X. Robust CRISPR/Cpf1(Cas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton (). Plant Biotechnology Journal, 2019, 17(10): 1862-1864.

[28] Wang P C, Zhang J, Sun L, Ma Y Z, Xu J, Liang S J, Deng J W, Tan J F, Zhang Q, Tu L L, Henry D,Jin S X, Zhang X L. High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton () using CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal,2018, 16(1): 137-150.

[29] 吳元龍, 惠鳳嬌, 潘振遠, 尤春源, 林海榮, 李志博, 金雙俠, 聶新輝. 后基因組時代發展抗除草劑作物的機遇及挑戰. 中國農業科學, 2023, 56(17): 3285-3301.

WU Y L, HUI F J, PAN Z Y, YOU C Y, LIN H R, LI Z B, JIN S X, NIE X H. Opportunities and challenges for developing herbicide- resistance crops in the post-genomic era. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3285-3301. (in Chinese)

Advancements in Herbicide-Tolerant Cotton Research and Breeding in China

LIANG Chengzhen1, JIN Shuangxia2

1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.001

2023-07-27；

2023-08-01

國家自然科學基金（32072115）、中國農業科學院科技創新工程、中國農業科學院生物技術研究所基本科研業務費

通信作者梁成真，E-mail：liangchengzhen@caas.cn。通信作者金雙俠，E-mail：jsx@mail.hzau.edu.cn

（責任編輯 李莉）