MicroRNA-384在腦膠質瘤細胞株中的表達以及臨床意義*

陳 俠，賴滿香，劉筱藹，來慧麗

廣東食品藥品職業學院護理學院，廣東 廣州 510520

膠質瘤來源于神經膠質細胞，也是最常見的顱內惡性腫瘤類型，約占全部惡性腫瘤的75%。膠質母細胞瘤具有浸潤性生長、惡性程度高、復發率高、難治愈等特點［1］。世界衛生組織將腦膠質瘤可分為Ⅰ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期為低分級，Ⅲ～Ⅳ期為高分級，其中Ⅰ期為良性，Ⅳ期侵襲性以及惡性程度最高，嚴重威脅患者的生命安全［2-3］。因此臨床對于腦膠質瘤的發生機制、病情發生以及發展進行不斷研究，以期尋找新的腦膠質瘤的基因治療手段［4-5］。隨著基因技術的發展，有研究學者利用芯片技術在膠質瘤細胞株檢測到5 000 多個生物基因，其中多種MicroRNA 表達異常。MicroRNA 是一種具有調控功能的非蛋白質編碼單鏈小分子RNA，可通過轉錄抑制翻譯而發揮對基因調控作用［6-7］。近年來，有研究明確了MicroRNA-384在結腸癌、肺癌以及肝癌等多種惡性腫瘤細胞的發生機制中有著至關重要的作用，但未對MicroRNA-384在腦膠質瘤細胞株中表達變化進行闡述［8］。為此，本研究就MicroRNA-384在腦膠質瘤細胞株表達變化以及臨床意義進行深入探究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究材料低分級腦膠質瘤細胞株（3 例）、高分級腦膠質瘤細胞株（5例）、正常腦組織細胞株（7例）均購買于中國科學院上海細胞生物所，RPMI1640 培養基、高糖DMEM、胎牛血清（FBS）均購買于杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；總RNA 提取試劑盒購買于上海信裕生物科技有限公司；反轉率試劑盒、PCR購買于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養 細胞株采用在含有高糖DMEM 與10%的胎牛血清培養基中進行培養，并放置在37 ℃且含有5%CO2的培養箱中培養，每天更換液體1次，3～4 d傳代1次［9］。

1.2.2 RNA 的提取 根據總RNA 提取試劑盒說明書進行提取，將細胞株放置在微量離心機中以800 r/min 的低速離心處理3 min，應用巴斯德吸管吹打15～30 次，取單細胞懸液，放置在有RNA 酶的離心管中，加入三氯甲烷250 μL，充分搖勻后，靜止5 min［13］。繼續放置在離心機中分離。完成后，將液體吸干，放置在50 ℃環境中，促進RNA 進一步的降解。并應用分光光度儀測量所得RNA 的濃度，并將樣本放置在-75 ℃環境冷凍處理［10］。

1.2.3 反轉錄 將無RAN 酶的PCR 管加入2 μg 的RNA 溶液，依次加入清洗緩沖液（5 μL）、反轉錄試劑（2 μL）、抑制劑（0.330 μL）以及逆轉錄酶（200 u/μL）后，得到cDNA［11-12］。

1.2.4 定量PCR 取0.2 μL cDNA 加入0.2 mL PCR 試劑管中，與2 μL 的5.5 μM 基因產物、2.5 μL 的cDNA、7.0 μL的去RNA 酶水進行PCR 反應，并應用U6 作為內參。95 ℃預變性5 min，40個循環，95 ℃15 s，60 ℃退火30 s［13］。

1.2.5 細胞培養及轉染 腦膠質瘤細胞系U251 購買于中國科學院上海細胞生物所，用10%的胎牛學清、150 μg/mmL鏈霉素以及150 μg/mmL 青霉素高糖DMEM 培養基進行培養，參照轉染試劑盒對膠質瘤細胞系轉染MicroRNA-384。

1.2.6 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將稀釋好護的基質膠均勻鋪墊在Transwell 小室，放置在室溫37 ℃環境下凝固30 min，將轉染后的細胞根據接種密度含有預處理后的6 孔板總，細胞接種在Transwell 小室，加入200 μL無血清中的DMEM 的培養基中，加入含有10%胎牛血清400 μL 中，應用無菌棉簽擦拭Transwell 小室上表面的細胞和基質膠，并轉移至晶紫染液總，溫室反應15 min 后，在顯微鏡下挑選7 個計數拍照，計算其平均數，重復3 次實驗。

1.3 統計學方法

采用SPSS 27.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

腦膠質瘤細胞株（8 株） MicroRNA-384 的含量為（0.25±0.08），與膠質瘤組織旁正常組織細胞株（7 株）中MicroRNA-384 的含量（0.37±0.05）比較，差異有統計學有意義（P＜0.05）。

不同病理分級腦膠質瘤細胞株中MicroRNA-384的含量比較，高分級腦膠質瘤細胞株（5 株）中MicroRNA-384 的含量（0.24±0.03）低于低分級腦膠質瘤細胞株（3 株）中MicroRNA-384 的含量（0.31±0.04），差異有統計學有意義（P＜0.05）。

不同時間MicroRNA-384 組的U251 細胞增殖抑制率高于正常細胞組，腦膠質瘤細胞株中MicroRNA-384表達受到抑制，隨著培養時間延長其促進或抑制效果更明顯，差異有統計學有意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組不同時間點U251細胞增殖情況（±s）

表1 兩組不同時間點U251細胞增殖情況（±s）

組別不轉染任何基因組（n=4）MicroRNA-384組（n=4）t值P值12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 4.27±2.364.97±0.725.16±0.815.31±1.456.27±2.36 11.36±3.0117.36±5.2422.39±6.0129.19±6.3728.36±5.72 3.707 0.010 4.684 0.003 5.682 0.001 7.311＜0.001 7.139＜0.001

3 討論

腦膠質瘤屬于高發性惡性腫瘤，其發病率是人類腦瘤中的第2 位，僅次于腦膜瘤，中位生存期不足9 個月，且具有較高的侵襲性，手術后易復發，5年生存率不足3%［14］。目前，許多臨床醫生對于手術治療腦膠質瘤力求全切，但是部分患者腫瘤生長位置較為特殊，在手術治療后會存在部分殘留。而對于腦膠質瘤的藥物治療相對單一，除低級別可全部手術切除的腦膠質瘤外，應采取放化療治療。但是在化療藥物中，特異性與療效較高的藥物較少，導致患者的生活質量以及預后得不到明顯的改善，為此尋找新型的標記物對腦膠質瘤的早期診斷以及預后具有積極的影響。

近幾年來，隨著醫學的發展，對miRNA 的不斷深入研究，膠質瘤的治療手段也取得較大的進展。miRNA 在疾病的發生發展占據不可估量的作用。miRNA 是一種可以通過RNA 序列轉錄成具有功能性的RNA 小分子，雖然不能轉化為蛋白質，但是可對靶分子mRNA 進行識別并與其配對，導致蛋白質的翻譯受到抑制，從而在多種疾病中發揮其獨特的作用。一直以來，由于miRNAs不編碼蛋白而未引起學者們的重視，但是人們發現30%以上的人類基因因miRNAs靶點而成為人類最豐富的調控基因之一。其不僅數量巨大，且在動植物細胞以及分子過程中具有關鍵的作用。另外，miRNA 可以通過mRNA 與調節基因調控蛋白，與腫瘤轉移、發展等過程存在關聯，發揮著抑制癌基因的生理作用。此外， miRNA 具有較為顯著的組織特異性，尤其是在惡性腫瘤中表達更為明顯。根據miRNA 這一特點，腫瘤細胞株中某種miRNA 的表達可作為腫瘤診斷標志物，為腫瘤的靶向治療提供新思路。腫瘤細胞中存在miRNA的片段，不同miRNA 在腫瘤中所產生的生物學效應有所不同。miRNA 存在于腫瘤中的發生改變的染色體區域內，而腫瘤的易感性與miRNA 的病變、缺失、擴增相關。因而，檢測腫瘤細胞株內的miRNA 對疾病的嚴重程度以及預后等具有積極的意義。本研究發現，MicroRNA-384 在腦膠質瘤中表達下調，且隨著病理級別的升高，MicroRNA-384的表達水平顯著下調。

MicroRNA-384 屬于一種少有研究的保守型miRNA，隨著基因技術的進步，越來越多的研究學者開始探索MicroRNA-384 在腫瘤細胞中的作用機制。有研究［15］發現，MicroRNA-384 在胰腺癌細胞株中呈低表達，并通過細胞體外侵襲實驗發現MicroRNA-384 的上調可抑制腫瘤細胞的遷移以及侵襲。白曉斌等［16］研究中發現，在肺癌中，MicroRNA-384 的上調可抑制長鏈非編碼RNA的NEAT1（核富集轉錄體）的分裂以及增值等。由此說明，MicroRNA-384具有抑制癌細胞的作用［16］。分析MicroRNA-384 可靶向的抑制PIWIL4 基因的轉錄后的翻譯水平，繼而可調節下游的STAT3、鋅指轉錄因子、VEGF 的表達，從而促進體內的腫瘤細胞的消退。

本研究中，腦膠質瘤細胞株中MicroRNA-384 的含量明顯低于膠質瘤組織旁正常組織細胞株中MicroRNA-384的含量。且MicroRNA-384 的含量隨著腦膠質瘤病理分期的升高而降低。不同時間MicroRNA-384 組的U251 細胞增殖抑制率高于正常細胞組。不同時間MicroRNA-384 組的U251 細胞增殖抑制率高于正常細胞組，腦膠質瘤細胞株中MicroRNA-384 表達受到抑制，隨之培養時間延長其促進或抑制效果更明顯，表明MicroRNA-384 在腦膠質瘤的發生發展中有著重要的意義，且隨著腫瘤的惡性程度增加而表達降低。通過體外細胞實驗表明，MicroRNA-384 可表達抑制腫瘤細胞增殖與侵襲。

綜上所述，MicroRNA-384 在腦膠質瘤中呈低表達，且隨著病理分級程度的升高而降低，腦膠質瘤細胞株中MicroRNA-384 表達受到抑制，隨之培養時間延長其促進或抑制效果更明顯，且不同時間MicroRNA-384 組的U251細胞增殖抑制率高于正常細胞組，其含量的測定可評估腦膠質瘤分化程度，為臨床靶向治療提供新思路。