基于網絡藥理學和分子對接研究華蟾素治療胃癌的作用機制

李時超，陳 騰，秦鳳鳳，陳 超，李五生，王 杰*

（1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 200062； 2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；3.安徽醫科大學上海普陀中心臨床學院，上海 200062； 4.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610075）

胃癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，雖然在全球范圍內其發病率有所下降，位居惡性腫瘤的第6 位，但是其死亡率卻位居第3 位［1］。我國是胃癌的高發地區，其發病率和死亡率居惡性腫瘤的第2 位［2］。胃癌的治療是以手術為主，輔以化療、放療等綜合治療。中醫藥是胃癌防治中重要的組成部分，在癌前病變的預防，延長患者生存期，減輕化療不良反應等方面有一定的優勢［3］。

華蟾素是蟾酥的提取物，可用于治療胃癌，研究顯示，華蟾素能提高晚期胃癌化療的反應率和疾病控制率，改善晚期胃癌患者的生活質量［4］，但是由于華蟾素有效成分比較復雜，進一步對其有效成分和作用機制的研究是促進華蟾素臨床應用的基礎。

網絡藥理學是基于系統生物學和生物信息學，通過將藥物、靶點、疾病靶基因交集在具有多層次交互作用的生物網絡系統中的一門新學科［5］。分子對接是基于計算機模擬結構的方法，通過對接的手段在分子水平上預測配體-受體的相互作用，或評估構效關系，以識別具有治療意義的化合物的一項新技術［6］。本研究擬通過網絡藥理學和分子對接的方法，研究華蟾素治療胃癌的分子機制和物質基礎，為臨床應用華蟾素輔助治療胃癌提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 華蟾素成分篩選及預測靶點獲取 檢索PubMed、CNKI、萬方、VIP 數據庫得到華蟾素抗腫瘤的主要物質，檢索PubChem 數據庫 （http： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 獲取華蟾素成分的分子結構及Canonical SMILES 號，通過 SwissTargetPrediction （ http： / /swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper （http： / /lilab-ecust.cn/pharmmapp）、TargetNet （http： / /targetnet.scbdd.com/homeer） 網站預測華蟾素成分靶點，采用UniProt Knowledgebase （UniProtKB，http： / /www.uniprot.org/） 校 正 后，以 SwissTarget Prediction Prob ≥ 0.10、TargetNet Prob ≥ 0.60 或PharmMapper Fit≥0.60 為條件篩選預測靶點。

1.2 胃癌疾病基因獲取 以“gastric cancer” 為關鍵詞，種屬限定為“Homosapiens”，搜索治療目標數據庫（TTD，http： / /bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd）、在線孟德爾人類遺傳數據庫 （ OMIM，http： / /www.omim.org/）、DisGeNET 數 據 庫 （ http： / /www.disgenet.org ）、GeneCards 數據庫 （https： / /www.genecards.org/），以GeneCards 得分≥10 分、DisGeNET≥0.10 為篩選條件，刪除重復基因，得到胃癌疾病基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點及其蛋白相互作用網絡構建 通過R 軟件將華蟾素主要成分的預測靶點與胃癌疾病基因取交集，得到藥物-疾病共同靶點。通過String 平臺構建藥物-疾病共同靶點的蛋白相互作用（PPI） 網絡，將蛋白種類設置為 “Homosapines”，最低相互作用閾值設為中等“medium confidence” （0.4），其他為默認設置。然后下載tsv 格式文件，導入Cytoscape 3.7.2 軟件，并根據網絡節點度值來評價主要靶點，每個節點代表1 個基因，度值與節點相連節點的數量相關，度值越大，節點在網絡中越重要。

表1 華蟾素主要成分信息

1.4 華蟾素-胃癌共同靶點生物功能和通路分析 采用ClusterProfiler R 軟件對華蟾素-胃癌共同靶點進行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 的通路富集分析。

1.5 藥物-靶點-疾病相互作用網絡構建 將華蟾素與胃癌共同靶點PPI 的tsv 格式文件導入Cytoscape 軟件中，構建藥物-靶點-疾病可視化的網絡模型，網絡中的節點代表藥物成分、疾病靶基因，通過度值篩選華蟾素治療胃癌的關鍵成分和靶點。

1.6 關鍵靶點與胃癌預后的相關性 通過Kaplan-Meier 在線網站（http： /kmplot.com/analysis/） 選擇胃腺癌數據庫，輸入篩選出的關鍵靶點，得到與胃癌總體生存期相關的風險比（HR） 和log rank 檢驗的P值，P＜0.05 表示該靶點與胃癌的臨床預后風險密切相關。

1.7 華蟾素主要成分與關鍵靶點分子對接 從PubChem數據庫（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載配體化合物的3D 結構并轉換格式，從PDB 數據庫（https： / /www.rcsb.org/） 中下載受體蛋白3D 結構，采用Pymol 軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，Auto Dock軟件將化合物及靶蛋轉換為*pdbqt 格式，Vina 軟件進行分子對接，Pymol 軟件分析配體和受體的相互作用。

1.8 核心靶點與胃癌臨床預后風險的單因素、多因素Cox回歸分析 通過網絡藥理學、分子對接、臨床預后數據庫結果篩選出核心基因靶點，通過R 語言中的survival 包在TCGA、GEO （GSE15459） 胃癌數據庫中進行單因素Cox回歸分析，在TCGA 數據庫中將篩選出的核心基因靶點通過R 語言中的survival 包進行多因素Cox 回歸分析，構建預后風險評分模型，以評價核心靶點與胃癌臨床風險預后的關系。再計算風險評分，公式為風險評分＝基因1 表達量×多因素Cox 回歸系1＋…＋基因N表達量×多因素Cox 回歸系數N（其中N代表基因數），計算每例患者的風險評分，通過survival 包中的surv_ cutpoint 函數計算cutoff 值，將患者劃分為高風險組和低風險組，采用R 語言中的survminer包繪制Kaplan-Meier （KM） 生存曲線，計算2 組患者的生存率以評價模型性能。

2 結果

2.1 華蟾素主要成分及其預測靶點 參考文獻［7-8］ 報道，蟾毒內酯類、吲哚生物堿類為華蟾素抗腫瘤的主要活性成分，將這2 類成分所含的化合物通過檢索PubChem 數據庫得到含有分子結構的化合物28 個，其中蟾毒內酯類有20 個，分別為華蟾毒它靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、遠華蟾蜍精、日蟾蜍他靈、沙蟾毒精、蟾毒靈、蟾蜍他靈、偽異沙蟾毒精、resibufaginol、脂蟾蜍精、去乙酰華蟾蜍精、華蟾蜍毒醇、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈寧、海蟾蜍精、19-羥基蟾毒靈、嚏根草醇、蟾蜍它里定、偽異沙蟾毒精；吲哚生物堿類有8 個，分別為蟾蜍硫堇、蟾蜍特尼定、蟾毒色胺、五羥色胺、脫氫蟾蜍色胺、N-乙酰羥色胺、5-羥基吲哚-3-甲醛、蟾蜍色胺C，具體見表1。按篩選條件將各數據庫預測靶點匯總，去重后得到484 個華蟾素主要成分的預測靶點。

2.2 胃癌疾病靶點 按篩選條件，得到各數據庫靶點為TTD 數據庫41 個、OMIM 數據庫484 個、DisGeNET 數據庫290 個、GeneCards 數據庫311 個，刪除重復基因后得到胃癌疾病基因981 個。

2.3 藥物-疾病共同靶點及其PPI 網絡 將華蟾素主要成分的預測靶點與胃癌疾病基因取交集，得到兩者共同靶點70 個。通過String 平臺和Cytoscape 3.7.2 軟件得到70 個藥物-疾病共同靶點的PPI 網絡圖，見圖1～2。PPI 網絡圖中，SRC （度值50）、CTNNB1 （度值48）、MAPK1 （度值47）、MAPK3 （度值47）、STAT3 （度值46）、EGFR （度值44）、ALB （度值43）、MTOR （度值42）、ESR1 （度值41）、IL6（度值40） 是度值靠前的節點，可能為華蟾素治療胃癌的主要靶點。

圖1 華蟾素與胃癌共同靶點PPI 網絡

圖2 華蟾素與胃癌共同靶點（排名前20 位）

2.4 華蟾素-胃癌共同靶點GO 生物功能分析 華蟾素治療胃癌的靶點影響了1 399 個生物學過程、75 個分子功能，生物過程主要包括肽基絲氨酸磷酸化、肽基絲氨酸修飾、對氧化應激的反應、蛋白激酶B 信號傳導、細胞對氧化應激的反應、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、對活性氧的反應等，分子功能主要包括蛋白質酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、組蛋白激酶活性、核受體活性等。排名前二十的生物過程、分子功能富集結果見圖3～4。

圖3 華蟾素與胃癌共同靶蛋白涉及的生物過程GO 富集分析

圖4 華蟾素與胃癌共同靶蛋白涉及的分子功能GO 富集分析

2.5 華蟾素-胃癌共同靶點的KEGG 通路富集分析 共得到145 條信號通路，P值排名前20 位的見圖5，主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、前列腺癌、內分泌抵抗、癌癥中的蛋白聚糖、胃癌、ErbB 信號通路、乳腺癌、神經膠細胞瘤等。

圖5 華蟾素與胃癌共同靶蛋白KEGG 富集分析（排名前20 位）

2.6 構建藥物-靶點-疾病相互作用網絡 由圖6 可知，華蟾素治療胃癌的主要化合物是華蟾毒它靈（度值15）、蟾毒它靈（度值12）、華蟾酥毒基（度值8）、蟾蜍色胺C（度值8）、蟾毒靈（度值6），關鍵靶點有SRC （度值51）、CTNNB1 （度值49）、MAPK1 （度值48）、MAPK3 （度值48）、STAT3 （度值47）、EGFR （度值45）、ALB （度值44）、ESR1 （度值43）、MTOR （度值42）、IL6 （度值41）。

圖6 華蟾素-靶點-胃癌相互作用網絡圖

2.7 關鍵靶點與胃癌預后的相關性 結果見表2、圖7A～7B，可知SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、EGFR、ALB、ESR1 的log rank 檢驗P＜0.05，表明這些靶點與胃癌總體生存期存在明顯相關性，也與胃癌的臨床預后風險密切相關。

圖7 部分核心靶點與胃癌預后的相關性及與resibufaginol 的分子對接圖

表2 關鍵靶點與胃癌總體生存期的相關性

2.8 華蟾素主要成分與關鍵靶點的分子對接 分子對接結合能小于0，表示配體與受體可自發結合，并且當結合能≤-5.0 kJ/mol 時，小分子配體與受體結合較好［9］。將華蟾素主要成分分別與 SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、ALB、MTOR、ESR1、IL6 進行分子對接，發現其結合能大多小于等于-5.0 kJ/mol，見圖7C～7D、圖8，說明華蟾素主要成分與胃癌關鍵靶點間有較好的結合活性，其中所有關鍵靶點與華蟾素主要成分resibufaginol（-112.4 kJ/mol）、華蟾酥毒基（-81.9 kJ/mol）、偽異沙蟾毒精（-79.9 kJ/mol）、沙蟾毒精（-79.7 kJ/mol）、華蟾蜍毒醇（-79.3 kJ/mol） 結合能較好，華蟾素主要與關鍵靶點EGFR （- 143.0 kJ/mol）、MTOR （-139.8 kJ/mol）、MAPK3 （-139.3 kJ/mol）、ALB （-137.9 kJ/mol）、STAT3（-136.3 kJ/mol） 結合能較好，表明這些靶點與華蟾素的主要成分更容易結合。結合“2.7” 項下結果可知，這些靶點中EGFR、MAPK3、ALB 與胃癌預后密切相關，推測三者可能是華蟾素治療胃癌的核心靶點。

圖8 華蟾素主要成分與關鍵靶點的分子對接熱圖

2.9 核心靶點與胃癌臨床預后風險的單因素、多因素Cox回歸分析 對篩選出的3 個核心基因靶點 （EGFR、MAPK3、ALB） 進行單因素Cox 回歸分析，發現在TCGA數據庫中核心靶點EGFR、ALB 與胃癌臨床預后風險有關，在GEO 數據庫中核心靶點MAPK3 與胃癌臨床預后風險有關，具體見表3。在TCGA 數據庫中對3 個核心基因靶點進行多因素Cox 回歸分析，得到胃癌預后風險評分模型，計算風險評分，公式為風險評分＝EGFR 表達值×0.153 ＋MAPK3 表達值× （-0.067 2） ＋ALB 表達值×0.09，對每例胃癌患者進行風險評分，通過surv_ cutpoint 函數計算出cutoff 值為0.285 197 9，并據此分為高風險組（96 例） 和低風險組（292 例）。KM 分析結果顯示，與低風險組比較，高風險組患者總體生存率更低（P＜0.01），表明華蟾素治療胃癌的3 個核心靶點與胃癌臨床預后密切相關，見圖9。

圖9 核心靶點與胃癌臨床預后風險的多因素Cox 回歸分析

表3 核心靶點與胃癌臨床預后風險的單因素Cox 回歸分析

3 討論

中醫藥在腫瘤防治中的作用越來越引起人們的重視，但由于中醫藥成分的復雜性和作用機制的不確定性，阻礙了中醫藥在腫瘤疾病中的廣泛應用［10］。網絡藥理學從整體的角度闡明中醫藥的作用機制和作用成分，有利于中醫藥的現代化研究［11］。胃癌屬中醫“噎膈” “胃返” “積聚”等范疇，病機以正虛為本、癌毒為標，而癌毒蘊結于胃是其發病的關鍵，癌毒不除，疾病難愈［12］?！督饏T要略心典》曰： “毒者，邪氣蘊蓄不解之謂”，因此癌毒致病，法當解毒。而華蟾素具有解毒、消腫、止痛之功，在胃癌的輔助治療中具有良好的療效。

本研究顯示，華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒靈是華蟾素治療胃癌的關鍵成分，除蟾蜍色胺C 外都是華蟾素的主要成分之一，這些關鍵成分在多種腫瘤的治療中顯示多重作用。研究表明，華蟾毒它靈增加耐藥腫瘤細胞對順鉑的敏感性［13］。蟾毒它靈能促進黑色素瘤［14］和食道癌［15］細胞的凋亡，抑制腫瘤的增殖。華蟾素主要成分的華蟾酥毒基的作用較為廣泛，可以通過抑制自噬增加胃癌細胞的凋亡［16］，對乳腺癌細胞具有抗增殖和促凋亡作用［17］，抑制腸癌的血管生成［18］、逆轉P-gp 介導的腸癌多藥耐藥性［19］。蟾蜍色胺C 是一種新型的吲哚類生物堿，有研究顯示它對肺癌A549 細胞的毒性強于5-FU［20］。蟾毒靈是華蟾素成分中研究最熱門的物質，在胃癌中蟾毒靈能通過下調Wnt/ASCL2 表達來抑制胃癌的侵襲和轉移［21］，逆轉胃癌細胞對順鉑的耐藥性［22］，抑制保護性自噬發揮抗胃癌作用［23］。

本研究篩選出了華蟾素治療胃癌的核心靶點是EGFR、MAPK3 （又稱ERK1）、ALB，相關文獻也證實了篩選結果。另外，華蟾素的關鍵成分蟾毒靈能通過EGFR/AKT/ERK 信號通路抑制卵巢癌細胞的增殖［24］； 蟾毒靈可通過調節胃癌細胞中的ERK 信號通路來發揮抗癌作用［23］； 蟾毒靈可通過調節肝癌細胞中ALB 和AFP 的表達來逆轉細胞的惡性表型并促進其分化和成熟［25］。

本研究中華蟾素抗胃癌涉及的KEGG 核心通路是EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，富集了最多的靶點。在篩選出華蟾素治療胃癌的關鍵靶點中，SRC、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、mTOR 與核心通路EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路相關，華蟾素及其主要成分對核心通路中的這些靶點的作用都有相關研究報道。其有效成分蟾毒靈是SRC-3 和SRC-1 的有效小分子抑制劑［26］，能夠抑制EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路的激活； 華蟾素可以通過抑制c-Met/ERK 信號通路的上皮間質轉化來阻止肝癌HepG2 細胞遷移和侵襲［27］； 華蟾酥毒基可通過阻斷IL-6/STAT3 信號通路抑制骨肉瘤細胞的活力和成瘤能力［28］； 蟾毒靈可通過靶向mTOR/HIF-α 途徑抑制卵巢癌增殖和遷移［29］。

綜上所述，華蟾素治療胃癌的關鍵成分為華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒靈，可能通過調控EGFR、MAPK3、ALB、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、內分泌抵抗、癌癥中的蛋白聚糖等多靶點、多途徑發揮對胃癌的治療作用，以期為進一步的臨床或實驗研究提供科學依據和研究思路。