右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經元凋亡及BDNF/TrκB信號通路的影響

趙 莉， 范翠翠

癲癇是一種腦功能障礙的慢性綜合征，神經元突發性異常放電是其主要原因［1］。在癲癇發作過程中，機體神經化學和生理學功能異常，可造成腦水腫、心律失常、體溫失調、電解質和葡萄糖的紊亂、橫紋肌溶解綜合征以及認知功能受損等，甚至猝死［2］。神經元凋亡是癲癇發作后大腦損傷的重要形式［3］。因此，防治癲癇發作后神經元凋亡具有重要意義。研究顯示，腦源性神經營養因子（BDNF）以及介導其生物學效應的受體-酪氨酸激酶受體B（TrκB）與多種神經系統疾病的發生發展都有關［4］。研究顯示，激活BDNF/TrκB信號通路可以改善阿爾茨海默病大鼠的記憶障礙［5］。作為一種α2-腎上腺素受體激動劑，右美托咪定具有抗交感、鎮靜及鎮痛等作用［6］。右美托咪定對腦血管病也具有治療效果，楊永紅等［7］研究發現，右美托咪定在改善腦缺血再灌注大鼠神經損傷方面療效顯著。但其在抗癲癇方面的作用以及機制尚不清楚。本研究擬基于BDNF/TrκB信號通路，探討右美托咪定對癲癇發作后海馬神經元凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級別雄性SD 大鼠，8～10 周齡，體質量244～274 g，購自南京偉沃生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（蘇）2021-0012，大鼠飼養于溫度為（21～24）℃，相對濕度為（57～62）%，12 h光暗循環的環境中，本研究經復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院倫理委員會批準（批準編號：JCLS-2022-11-02）。

1.1.2 主要藥物與試劑 鹽酸右美托咪定注射液、氯化鋰、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素（IL-6）ELISA 試劑盒、鹽酸匹羅卡品、BCA 試劑盒（批號分別 為 DS29050、DS14681、DS58930、DS23582、DS28442、DS53821）均購自江西中洪博元生物技術有限公司；BDNF/TrκB 通路激活劑（LM22B-10，純度＞99%）、TUNEL 凋亡檢測試劑盒、硫酸阿托品、ECL試劑、蛋白裂解液（批號分別為BS25011、BS49142、BS52855、BS27589、BS59202）均購自杭州鉑賽生物科技有限公司；鼠源β-微管蛋白Ⅲ（Tuj1）一抗、羊抗鼠二抗、兔源BDNF、TrκB、B 細胞淋巴瘤-2 相關X 蛋白（Bax）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、β-actin、羊抗兔二抗（批號分別為KJ10940、KJ52015、KJ58292、KJ25829、KJ57193、KJ53820、KJ25810、KJ41847）均購自江蘇凱基生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 LW3000T 型顯微鏡、SpectraMax M2 型酶標儀、Quantum CX5 型凝膠成像儀均購自武漢天德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型的建立及分組給藥 構建癲癇大鼠模型［8，9］：大鼠腹腔注射127 mg/kg 的氯化鋰溶液，24 h后腹腔注射1 mg/kg的硫酸阿托品，30 min后注射30 mg/kg 的鹽酸匹羅卡品。根據Racine 分級進行癲癇發作評定［10］，Ⅰ：嘴和面部抽動；Ⅱ：肌陣攣性運動，但無直立；Ⅲ：肌陣攣，伴直立；Ⅳ：全身陣攣性直立；Ⅴ：全身強直陣攣，姿勢控制喪失（摔倒）。造模成功的標準是達Racine 分級Ⅳ以上，并持續15 min以上［8］。將造模成功的36只大鼠隨機分為模型組、右美托咪定組（50 μg/kg）［11］、右美托咪定+LM22B-10 組（50 μg/kg+5 mg/kg）［12］，每組12 只。另取12 只健康大鼠按照上述造模方法注射等量生理鹽水作為對照組。

建模結束后，右美托咪定組根據參考文獻［11］給予大鼠50 μg/kg 右美托咪定腹腔注射（將右美托咪定和生理鹽水混溶成濃度為5 μg/ml的溶液，注射體積10 ml/kg）；右美托咪定+LM22B-10 組大鼠給予50 μg/kg 右美托咪定腹腔注射和5 mg/kg LM22B-10側腦室注射［12］（將右美托咪定、LM22B-10 分別和生理鹽水混溶成濃度分別為5 μg/ml、0.5 mg/ml 的溶液，注射體積10 ml/kg）；對照組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。各組每天注射1次，連續1周。

1.2.2 大鼠癲癇發作頻率和持續時間觀察給藥結束24 h后，于上午9：00～12：00，下午3：00～6：00，記錄大鼠癲癇發作頻率和持續時間。

1.2.3 TUNEL染色觀察大鼠海馬神經元細胞凋亡情況 行為學觀察結束后，處死大鼠，收集海馬CA1區處腦組織，分為兩部分，一部分置于-70 ℃冰箱保存，另一部分用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，厚度為4 μm。取部分切片，脫蠟、復水，蛋白酶K工作液進行細胞通透操作，加入TUNEL 試劑常溫避光孵育1 h，含HRP 的抗熒光素抗體室溫避光孵育0.5 h，DAB 試劑顯色7 min，每一步驟間用PBS 漂洗3次（每次5 min），細胞核采用蘇木素復染，顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5 個視野，記錄視野內棕褐色的陽性染色細胞數，即為凋亡細胞數，計算平均值。

1.2.4 免疫熒光染色檢測大鼠海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞情況 取1.2.3 中石蠟切片，脫蠟洗滌后，進行抗原修復，室溫封閉1 h，加入稀釋好的鼠源Tuj1（1∶1 500）一抗，4 ℃孵育過夜，加入羊抗鼠二抗（1∶2 500），室溫孵育2 h，對細胞核進行DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光即為Tuj1陽性細胞。用Image J處理圖像，結果以Tuj1陽性細胞數目/mm2表示。

1.2.5 大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6水平的測定 取1.2.3中海馬CA1區腦組織，研磨勻漿，4 ℃下11 200 r/min 離心15 min，取上清，ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平的測定 取1.2.3 中大鼠海馬CA1區腦組織，研磨勻漿，蛋白裂解液裂解，定量總蛋白濃度，取蛋白樣品85 μg，電泳分離，轉膜，用5%的脫脂奶粉室溫下孵育1.5 h。加入稀釋好的兔源BDNF（1∶1 200）、TrκB（1∶1 450）、Bax（1∶1 500）、Bcl-2（1∶1 500）、β-actin（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（1∶2 400），室溫下孵育2 h，ECL 試劑顯影，以β-actin 為內參，Image J軟件分析定量各組蛋白的灰度值。

1.3 統計學分析

使用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 右美托咪定對癲癇大鼠癲癇行為的影響 與對照組相比，模型組大鼠癲癇發作頻率、持續時間顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠癲癇發作頻率、持續時間顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠癲癇發作頻率、持續時間顯著升高（P＜0.05）（見表1）。

表1 各組大鼠癲癇發作頻率、持續時間的比較（±s，n=12）

表1 各組大鼠癲癇發作頻率、持續時間的比較（±s，n=12）

與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.2 右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡和海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞的影響與對照組相比，模型組大鼠海馬神經元凋亡細胞數目顯著升高，海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞數目顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬神經元凋亡細胞數目顯著降低，海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞數目顯著升高（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬神經元凋亡細胞數目顯著升高，海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞數目顯著降低（P＜0.05）（見表2、圖1、圖2）。

圖1 各組大鼠海馬神經元TUNEL染色圖（400×）

表2 各組大鼠海馬神經元凋亡細胞數目和海馬CA1區腦組織Tuj1陽性細胞數目的比較（±s，n=12）

表2 各組大鼠海馬神經元凋亡細胞數目和海馬CA1區腦組織Tuj1陽性細胞數目的比較（±s，n=12）

與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.3 右美托咪定對癲癇大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）（見表3）。

表3 各組大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平的比較（±s，n=12，pg/mg）

表3 各組大鼠海馬CA1區腦組織中TNF-α、IL-6 水平的比較（±s，n=12，pg/mg）

注：與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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2.4 右美托咪定對癲癇大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的影響 與對照組相比，模型組海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，右美托咪定組、右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與右美托咪定組相比，右美托咪定+LM22B-10 組大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）（見圖3、表4）。

圖3 各組大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2 蛋白印跡圖

表4 各組大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較（±s，n=12）

表4 各組大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較（±s，n=12）

注：與對照組相比aP＜0.05；與模型組相比bP＜0.05；與右美托咪定組相比cP＜0.05。

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3 討 論

海馬神經元凋亡是癲癇持續狀態后神經細胞丟失的重要形式［13］。研究顯示，癲癇發作后還伴隨著神經炎癥反應，會引起腦組織細胞神經炎性損傷［14］。本研究構建癲癇大鼠模型，其病理學表現類似于顳葉癲癇，其行為表現遵循Racine標準。同時，模型組大鼠癲癇發作頻率、持續時間、海馬神經元凋亡細胞數目、海馬CA1區腦組織TNF-α、IL-6 水平較對照組顯著升高，表明癲癇大鼠神經元凋亡情況加重，存活神經元減少，同時伴隨炎癥反應。

右美托咪定可與不同的α2 受體亞型結合后產生相應的鎮靜、鎮痛、抗焦慮、血壓升高等作用。研究發現，右美托咪定能減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經炎癥和神經元損害，改善腦細胞凋亡，是一種神經保護劑［15］，其在臨床治療老年精神病患者無抽搐電休克方面效果顯著［16］。Bax和Bcl-2是凋亡調控蛋白，Bax 促進細胞凋亡，而Bcl-2 作為抗凋亡蛋白，功能與之相反［17，18］。Tuj1 是一種微管蛋白，也是神經元的標志物之一，其表達越高表示神經元存活數越多［19］。本研究結果發現，相比于模型組，右美托咪定組大鼠癲癇發作頻率、持續時間、海馬神經元凋亡細胞數目、海馬CA1區腦組織TNF-α、IL-6 水平、Bax 蛋白表達水平顯著降低，海馬CA1區腦組織Tuj1 陽性細胞數目、Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高，提示右美托咪定干預可以顯著降低癲癇大鼠的發作頻率和持續時間以及神經元凋亡數量，增加神經元存活數目，抑制炎癥反應。

BDNF 能影響神經元的存活、分化和維持，還在成熟海馬的興奮性和神經遞質合成方面具有重要調控作用［20］。作為BDNF 的受體TrκB，與BDNF結合時，引發酪氨酸磷酸化，進而觸發一系列級聯信號轉導，參與多種生理反應［21］。Javaid 等［22］研究報道，癲癇小鼠腦組織中BDNF/TrκB 信號傳導被激活，使得腦組織促炎細胞因子活性升高，而經噻加賓治療后癲癇小鼠腦組織氧化應激、BDNF/TrκB信號傳導和促炎細胞因子活性受到抑制，癲癇癥狀得到顯著改善［23］。除此之外，BDNF/TrκB 信號通路的激活還可引起海馬興奮環路的建立，導致細胞內鈣離子內流，增強興奮性突觸后電位［24］。本研究結果顯示，癲癇大鼠海馬CA1區腦組織中BDNF、TrκB 蛋白表達水平顯著升高，而右美托咪定干預后BDNF、TrκB 蛋白表達水平顯著降低。在右美托咪定基礎上添加BDNF/TrκB 通路激活劑LM22B-10后，癲癇大鼠發作頻率、持續時間以及海馬神經元凋亡細胞數目、海馬CA1區腦組織TNF-α、IL-6 水平、BDNF、TrκB、Bax蛋白表達水平較右美托咪定組顯著升高，海馬CA1區腦組織Tuj1陽性細胞數目、Bcl-2蛋白表達水平較右美托咪定組顯著降低，提示右美托咪定引起的減弱癲癇大鼠神經元細胞凋亡能力被LM22B-10 抑制，進一步提示右美托咪定可能通過阻斷BDNF/TrκB 通路的激活發揮改善大鼠癲癇發作、抑制海馬神經元凋亡及炎癥反應的目的。

綜上所述，右美托咪定能降低癲癇大鼠的癲癇發作以及抑制海馬神經元的凋亡，減輕大鼠炎癥反應，其機制可能與抑制BDNF/TrκB 信號通路的激活有關。但本研究僅探究了右美托咪定通過BDNF/TrκB 信號通路對癲癇大鼠的作用，右美托咪定能否通過其他信號通路發揮抗癲癇作用，有待后續研究。

倫理學聲明：本研究方案經復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院倫理委員會批準（批準編號：JCLS-2022-11-02）。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙莉負責論文設計、撰寫論文；范翠翠負責論文修改并最后定稿。