氮素對斜生四鏈藻生長的影響研究＊

袁 婷，魏 群，馬湘蒙，姚金潔，何潤瀅

（廣西大學資源環境與材料學院，廣西 南寧 530004）

目前，人類社會對燃料的需求日益增加，而常用的傳統燃料存在二次污染、成本高和不可再生等問題，故尋找替代燃料逐漸成為研究熱點[1]。以微藻為原料所生產的第三代生物柴油是極具發展潛力的替代燃料，因具有培養成本低、可再生等優勢而受到廣泛關注[2]。微藻具有生長快、適應性強及脂質含量高的特點[3]，其生長及生理特性會直接影響到生物柴油的質量，故為獲得高質量的生物柴油，要保持微藻良好的生長狀態。氮是藻細胞蛋白質、葉綠素等重要組成元素之一，同時也對調控微藻脂質的合成起到關鍵的作用[4]。多種形式的氮源均能被微藻吸收利用，但不同氮源對微藻的生長、生理特性的影響有所差異，研究表明，新綠藻（Neochlorisoleoabundans）在硝酸鹽培養下生長及脂質積累效果最好[5]；而二形柵藻（Scenedesmus dimorphus）更傾向于利用尿素[6]。此外，氮濃度也會影響微藻的生長及脂質積累，氮充足的條件有利于微藻的生長及脂質積累，同時也能保證微藻較好的生長狀態[7]。在氮缺乏或氮過量條件下，微藻的生長會受到抑制，但在氮限制下微藻的脂質等儲能物質含量較高[8-9]。目前氮源對微藻的研究主要集中在生長及脂質積累效果的影響方面，而對其他重要的生理指標的影響研究相對較少。因此，為更好地了解氮源及氮濃度對微藻的生長及生理特性之間的關系，需對此開展進一步的探究。

斜生四鏈藻（Tetradesmus obliquus）擁有優良的脂質生產性能，其在氮脅迫條件下脂質含量可達47.70%，具有一定的發展潛力[10]。實驗以斜生四鏈藻為研究對象，探究其在不同氮源及濃度條件下的生長及生理特性的影響，分析斜生四鏈藻的脂質含量、脂肪酸組成、蛋白質及葉綠素a等指標情況，進而優選出斜生四鏈藻最佳培養條件，保證微藻的高質量生長。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的藻種為斜生四鏈藻，編號：FACHB-12，曾用名斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

改良BG11培養基[11]（僅改變氮源及氮濃度）；硝酸鈉（NaNO3）、尿素（CH4N2O）、氯化銨（NH4Cl）、無水乙醇、硫酸、甲醇、氯仿、正己烷、丙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；考馬斯亮藍（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

BXM-75型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；AR124CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Smart2pure12型超純水儀（美國賽默飛世爾公司）；UV-8000型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機；JY92-II超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5975C型氣質聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 微藻培養

微藻均培養于1 L的錐形瓶中，培養溫度為25±1 ℃，使用熒光燈進行持續光照，光照強度60 μmol/m2/s并持續通入純凈的空氣，曝氣量為200 mL/min。實驗所用的培養基為改良的BG11培養基，除了氮源與氮濃度之外，其余成分均與常規BG11培養基相同。

在無氮BG11培養基中，設置硝酸鈉、氯化銨及尿素3種氮源，每個氮源均各設置3個氮濃度，分別為3.53、8.82及17.65 mmol/L（換算成N濃度相同）。將處于對數生長期的斜生四鏈藻離心，洗滌3次后，再將藻泥重懸于裝有不同氮源及氮濃度的改良BG11培養基培養，保持初始的生物量相同，并保持相同的培養條件。

1.3.2 微藻生物量

微藻生物量用干重（DW）表示。取適量藻液離心10 min后用去離子水清洗3次，然后將藻泥轉移至稱量皿中在65 ℃下干燥至恒重。通過測定稱量皿前后的差值得到微藻的DW。DW計算見式（1），生物量生產力（Pbiomass）計算見式（2）。

式中：DW為生物量干重(g/L），Pbiomass為生物量生產力（mg/L/d），W1和W2分別為稱量皿烘干前后的重量（g）；V為樣品的體積（L）；DW2和DW1分別為第t2天和第t1天的生物量（g/L）。

1.3.3 脂質含量(Clipid）和脂質生產力（PLipid）

采用重量法[12]測定微藻脂質。利用氯仿/甲醇（2∶1）混合溶液提取微藻細胞中的脂質，將提取液置于錫紙盒中烘干后冷卻稱重，計算公式見式（3）。脂質生產力PLipid（mg/L/d）按照式（4）進行計算。

式中：Clipid為脂質含量（%）；PLipid為脂質生產力（mg/L/d）；Q1和Q2分別為錫紙盒提取脂質前后的重量（g）；DW為微藻生物量（g/L）；DQx和DQ1分別為Tx和T1天的生物量（g/L）；Cx和C1分別為Tx和T1天的脂質含量（%）。

1.3.4 脂肪酸組成（FAME）

脂肪酸組成通過氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術測定[13]。向50 mg藻粉中添加3 mL的4%硫酸-甲醇溶液，然后在90 ℃下水浴1 h，待樣品冷卻至室溫后再添加1 mL的正己烷，充分震蕩后進行離心，取上層含有有機相進行測定。利用氣質聯用儀、火焰電離檢測器和高效毛細管柱對脂肪酸組成進行分析。

1.3.5 蛋白質

蛋白質采用考馬斯亮藍比色法測定[14]。取5 mL藻液超聲破碎10 min后，以4 000 rpm轉速離心10 min，往1 mL上清液后加入5 mL考馬斯亮藍試劑，將其混合靜置2 min，最后在595 nm波長下測定混合物的吸光值。

1.3.6 葉綠素a

葉綠素a（Chl-a）采用乙醇-丙酮超聲破碎法測定[15]。取5 mL藻液于離心管后在4 000 rpm轉速下離心10 min，移除上清液后往離心管中加入5 mL的丙酮乙醇混合溶液（v∶v=1∶1）。繼續超聲破碎10 min，在4 ℃的溫度下避光浸泡24 h。最后將樣品以4 000 rpm轉速離心10 min，利用分光光度計在645 nm和663 nm波長處測量上清液的吸光度，葉綠素a的計算見式（5）。

式中：Chl-a為葉綠素a 濃度（mg/L）；A645、A663分別為645 nm和663 nm處的吸光度值。

1.3.7 數據處理

采用OriginPro 2021b軟件作圖，并使用相關性分析插件進行相關性分析。使用Excel 與OriginPro 2021b軟件對實驗數據進行處理及分析，所有數據均為3組平行樣的平均值來表示。

2 結果與討論

2.1 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響

不同氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響如圖1所示。由圖1（a）可知，經過1 d的適應期后，斜生四鏈藻在不同氮源及氮濃度條件下，生物量呈現出不同的生長趨勢。尿素培養環境下的斜生四鏈藻生長效果最好，其次為硝酸鈉，最后為氯化銨。當以尿素、硝酸鈉為氮源時，微藻的干重隨著氮濃度的增加而增加，在2～5 d時微藻生長速度最快，在第8天時干重均達到最大值。而以氯化銨為氮源時，微藻的干重隨氮濃度增加而降低，微藻在0～3 d時呈現出明顯的生長趨勢，但在4～6 d時微藻干重才得到緩慢的提升，隨后生長趨向于平衡，且生物量干重始終低于其他組（P<0.05）。在第8天時，當氮濃度分別為3.53、8.82及17.65 mmol/L時，尿素組的微藻干重分別為0.72、0.79及0.96 g/L，硝酸鈉組的微藻干重分別為0.66、0.67及0.88 g/L，而氯化銨組的微藻干重僅為0.32、0.26及0.24 g/L。

圖1 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響

實驗結果表明，斜生四鏈藻更傾向于利用尿素與硝酸鈉，適當增加此類氮源的濃度可有效促進斜生四鏈藻的生長，而氯化銨并不利于其生長，這可能與氮源的代謝途徑緊密相關。已有研究表明，NH4+通過轉運蛋白進入細胞后能直接被微藻利用，轉化途徑相對簡單，因此通常被認為是微藻最優先吸收的氮源[16]。然而在研究中以氯化銨為氮源時斜生四鏈藻的生長卻受到抑制，這可能與藻液中游離的NH4+水解造成pH降低有關[17]。尿素通過轉運蛋白進入微藻細胞內轉化為NH4+后被微藻吸收，而NO3-進入微藻細胞后需要轉化為NO2-后再轉化為NH4+才能被微藻直接利用，需要消耗較多的能量，這可能是斜生四鏈藻干重尿素組略高于硝酸銨組的原因[18]。

由圖1（b）可知，不同氮源及氮濃度下，8 d內微藻的平均生物量生產力的變化趨勢與干重相似，以尿素為氮源培養的微藻平均生物量生產力整體最高，其次為硝酸鈉和氯化銨。以硝酸鈉與尿素為氮源時，微藻的平均生物量生產力隨氮濃度的增加而升高，而氯化銨與之相反。其中當氮濃度為17.65 mmol/L時，氯化銨、硝酸鈉與尿素的平均生物量生產力分別為11.83、98.29及102.25 mg/L/d。綜上所述，當以尿素為氮源，氮濃度為17.65 mmol/L時，斜生四鏈藻的生長效果要優于其他實驗條件。

2.2 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質積累的影響

氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質積累的影響如圖2所示，不同的氮源所培養的微藻脂質積累能力存在一定的差距。研究發現，隨著氮濃度的升高微藻的脂質含量反而降低。當氮濃度3.53 mmol/L時，3種氮源所培養的微藻脂質含量能達到最大值，尿素組、硝酸鈉組和氯化銨組分別為31.93%、29.48%和23.86%；而當氮濃度17.65 mmol/L時，尿素組、硝酸鈉組和氯化銨組的脂質含量分別僅為24.70%、23.62%和22.10%。

圖2 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質積累的影響

通常在氮源將被耗盡的條件下，微藻細胞內蛋白質及葉綠素的合成受到了限制，從而使得能量重新分配，向脂質等具有儲能作用的物質轉化，使得脂質含量增加[19]。而當氮濃度較高時，所有實驗組的脂質積累效果均較差，可能是在氮充足或氮過量的條件下，細胞內的能量主要傾向于合成葉綠素以及蛋白質等物質，故導致脂質含量較低[20]。此外，在脂質生產力方面，以氯化銨為氮源所培養的微藻脂質生產力隨著氮濃度的增加而降低，最低僅為2.81 mg/L/d，這可能是因為微藻的生長受到了抑制，從而使得脂質含量較低。而以尿素為氮源的微藻脂質生產力隨著氮濃度的增高出現先降低后上升的趨勢，在17.65 mmol/L時脂質生產力高達25.90 mg/L/d，這與微藻的生物量有關。綜上所述，尿素有利于微藻的脂質積累且能保證較高的脂質生產力，當氮濃度較低時微藻的脂質含量最高，氮濃度較高時脂質生產力最高。

2.3 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂肪酸組成的影響

脂肪酸組成是一種用于衡量脂質是否能生產生物柴油的重要指標，而不同種類的脂肪酸含量會隨著氮濃度的變化而發生改變[21]。研究中，氮源及氮濃度對微藻脂肪酸組成的影響如圖3所示。結果表明，斜生四鏈藻的脂肪酸主要為C16∶0（棕櫚酸）、C18∶1（油酸）和C18∶2（亞油酸），其他的脂肪酸含量較少。C18∶1是生物柴油的主要原料之一，會直接影響生物柴油的質量[22]。尿素組的C18∶1含量相對于硝酸鈉組和氯化銨組最高，當氮濃度為3.53 mmol/L時，尿素組C18∶1含量高達55.49%而C16∶0僅為30.38%，C18∶1占整體脂肪酸的一半以上，表明在此條件下生產的生物柴油具有較好的性能。而當氮濃度為17.65 mmol/L時，氯化銨組C18∶1含量最低而C16∶0含量最高，分別為40.26%和44.94%，表明在此條件下生產的生物柴油性能不穩定。

圖3 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂肪酸組成的影響

此外，由圖3可知，氮源種類對斜生四鏈藻脂肪酸組成影響較小，在同一濃度下，不同氮源C18∶1的占比差異較小，尿素實驗組要略高于硝酸組和氯化銨組；而氮源濃度的影響更為明顯，C18∶1的含量隨氮濃度的升高而降低，具有明顯的遞減趨勢，而C16∶0的變化趨勢與其相反。這可能是由于在低氮濃度下，微藻的飽和脂肪酸逐漸轉換為單不飽和脂肪酸，從而使得所生產的生物柴油性能更加穩定[23]。綜上所述，氮濃度是影響微藻脂肪酸組成的主要因素，在相同的氮濃度條件下，利用尿素培養的微藻所制備的生物柴油將具有更高品質。

2.4 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質的影響

蛋白質是微藻生長代謝中的主要成分之一，微藻的細胞質、細胞核及酶都含有大量的蛋白質[24]。氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質的影響如圖4所示。由圖4可知，以硝酸鈉和尿素為氮源的培養環境，更利于微藻蛋白質的合成，而尿素組的促進效果更為明顯。此外，不同濃度的氮源培養結果表明，相比于氮濃度，氮源種類更是微藻合成蛋白質的重要影響因素，氯化銨實驗室組微藻蛋白質含量隨著氮源濃度升高而降低，而尿素和硝酸鈉培養條件下的斜生四鏈藻蛋白質含量隨氮源濃度的升高而升高。這可能是由于高濃度氯化銨會導致培養環境變為酸性，從而抑制了微藻的生長，減少了蛋白質的合成，并造成蛋白質的破壞，從而導致蛋白質含量降低，這與先前的影響斜生四鏈藻生長的因素類似[25]。而相比于硝酸鈉，尿素在進入微藻體內后更易被轉化為NH4+，這可能是導致其有利于蛋白質合成的原因之一[26]。

圖4 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質的影響

2.5 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻葉綠素a的影響

葉綠素a（Chl-a）是一種重要的光合色素，反映了微藻的光合作用的效果[27]。氮源及氮濃度對斜生四鏈藻葉綠素a的影響如圖5所示。由圖可知，硝酸鈉組和尿素組的斜生四鏈藻Chl-a含量呈現較好的上升趨勢，而氯化銨組呈現出小幅波動的趨勢，且差異性顯著（P<0.05）。同時，3個濃度培養結果均表明，以硝酸鈉為氮源的Chl-a含量最高，當氮濃度為17.65 mmol/L時，Chl-a含量在第8天時達到最高值9.32 mg/L，表明以硝酸鈉為氮源所培養的微藻有利于生成Chl-a。這與先前的研究結果類似，即適宜濃度的硝酸鈉更有利于微藻進行光合作用，其光合色素含量較高[28]。以尿素為氮源所培養的微藻葉綠素a含量相對硝酸鈉較低，當氮濃度為17.65 mmol/L時，Chl-a含量在第8天時僅為6.51 mg/L，這可能是因為以尿素為氮源時微藻更傾向于將氮源合成蛋白質及脂質等物質而導致的。此外，氯化銨組的葉綠素量均較低，均在1～3 mg/L范圍內波動，變化幅度較小，可能與在酸性條件下微藻細胞的光合色素發生了降解有關[29]。

2.6 氮源及氮濃度對微藻生理指標的相關性分析

通過Pearson相關系數，對不同氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生理指標進行了相關性分析，當相關系數為正值時表明2個因素之間呈正相關，當相關系數為負值時則為負相關。如圖6所示，在3種氮源中氮濃度均與脂質含量呈高度負相關，表明高氮濃度均不利于微藻的脂質積累。氯化銨組的氮濃度僅與葉綠素a（0.75）呈正相關關系，和其他生理指標均為負相關，隨著氯化銨濃度的增加，微藻的生長及生理特性反而受到抑制，這表明氯化銨不適宜作為斜生四鏈藻的培養氮源。硝酸鈉組與尿素組的氮濃度與生物量、生物量生產力、蛋白質及葉綠素a之間均呈高度正相關性，表明適當提升此類氮源的濃度有利于微藻的生長，但在脂質生產力上二者呈現出不同的相關性，硝酸鈉組的相關系數為0.76，而尿素組的相關系數僅為0.35，這可能與尿素組的脂質生產力均在不同濃度下保持較高水平有關。因此，通過綜合分析可知尿素與硝酸鈉均有利于斜生四鏈藻的生長及脂質積累，但尿素在促進生長上更具優勢。

圖6 氮源及氮濃度與微藻生理指標之間的Pearson相關性

3 結論

（1）不同氮源培養的斜生四鏈藻的生長存在明顯差異。尿素最有利于斜生四鏈藻的生長，其次是硝酸鈉，氯化銨不利于斜生四鏈藻的生長。

（2）在適宜氮源（硝酸鈉及尿素）的培養下，斜生四鏈藻的生長及生理指標與氮濃度呈現不同相關性。脂質含量與氮濃度呈負相關，低氮濃度（3.53 mmol/L）有利于微藻的脂質積累及C18∶1（油酸）的合成，其中尿素組的脂質及C18∶1的含量最高，分別為31.92%與55.49%；生物量及其他生理指標均與氮濃度呈正相關，高氮濃度（17.65 mmol/L）有利于微藻的生長及蛋白質、葉綠素a的合成，尿素組的蛋白質含量最高為25.11 mg/L，硝酸鈉組的葉綠素a最高為9.32 mg/L。

（3）尿素為斜生四鏈藻的最佳培養氮源，且最佳氮濃度為17.65 mmol/L，在此最佳條件下培養微藻，能獲得最大的干重、生物量生產力及脂質生產力，分別為0.96 g/L、102.25 mg/L/d和25.90 mg/L/d，同時蛋白質、葉綠素a的含量均保持較高水平。