新消渴方調控PI3K/AKT/FOXO1信號通路改善2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗機制研究

史麗偉 孫敏 陳玉鵬 湯怡婷 吳倩 倪青

2013年我國成人糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率為10.4%[1]。2015年至2017年中華醫學會內分泌學分會在全國31個省進行的DM流行病學調查顯示,我國成人DM患病率11.2%[2]。從2000至2019年的20年間,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的患病率每年增長超過1.5%[3]。T2DM約占成人DM發病類型的90%以上。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)伴隨胰島β細胞功能缺陷所致的胰島素分泌減少是T2DM顯著的病理生理學特征[4]。目前積極改善IR仍是T2DM治療的關鍵策略之一[5]。新消渴方是在朱丹溪《丹溪心法》消渴方與葉天士《臨證指南醫案·三消》消渴方的基礎上繼承和創新而成,用于治療 T2DM IR陰虛熱盛證,收效頗佳。氧化應激是T2DM大鼠糖脂代謝紊亂及IR的重要機制之一[6],研究擬探討新消渴方改善T2DM大鼠糖脂代謝、IR、氧化應激的作用以及改善T2DM大鼠肝臟IR的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性SD大鼠40只,體質量(160±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京)2012-0001],飼養于中國中醫科學院廣安門醫院SPF II級實驗動物中心,每籠5～6只。實驗前大鼠適應性飼養1周,飼喂標準大鼠合成飼料(購自江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司),自由飲用純凈水,環境溫度、濕度適宜,12小時晝夜交替。

1.2 實驗藥物

新消渴方顆粒劑:由四川新綠色藥業科技發展股份公司生產,每劑相當于生藥:黃連10 g、地骨皮30 g、生地黃30 g、知母10 g、生石膏30 g、麥冬10 g、生白芍10 g、炙甘草6 g。大鼠給藥量按照《藥理實驗方法學》中“標準體重動物劑量計算表”確定,即按照人—大鼠體表面積換算系數7計算大鼠等效劑量。鹽酸二甲雙胍片由中美上海施貴寶制藥有限公司生產,500 mg/片×20片/盒,國藥準字H20023370。鹽酸二甲雙胍成人(70 kg)每日常用劑量為1.5 g,新消渴方每日常用劑量為5.04 g,以成人(70 kg)每日每公斤體重用藥量的7倍作為大鼠等效劑量。臨用時用0.9%生理鹽水配制成混懸液,灌胃體積10 mL/kg。

1.3 實驗試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、戊巴比妥鈉由美國SIGMA公司生產;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測試盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)測試盒均由南京建成生物工程研究所生產;大鼠胰島素測試盒由上海睿鉑賽生物科技有限公司生產。蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)抗體、p-AKT(Ser473)抗體、叉頭轉錄因子-1(forkhead box o1,FOXO1)抗體、p-FOXO1(Ser256)抗體、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抗體、p-GSK-3β(Ser9)抗體均購自CST公司;磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)抗體、β-Actin內參均購自博奧森生物技術有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP均購自索萊寶生物有限公司。全自動生化分析儀(BECKMAN 公司,美國),SynergyTMH1全功能酶標儀(BioTek公司,美國),離心機(TOMOS公司,美國),電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠),磁力加熱攪拌器(江蘇金城國勝實驗儀器廠),高速恒溫冷凍離心機(eppendorf公司,德國),蛋白印跡電泳系統(Bio-rad公司,美國),全自動凝膠成像系統(Bio-rad公司,美國),轉移電泳儀(北京六一儀器廠),電泳槽(北京六一儀器廠),微量移液器(eppendorf公司,德國),精密電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司,上海),冰箱(SIMENS 公司,德國)。

1.4 造模與分組

6周齡SPF雄性SD大鼠40只,適應性喂養1周,隨機分為正常飲食組10只和高脂飼料組30只。正常飲食組大鼠飼喂標準普通飼料,高脂飲食組大鼠飼喂高脂飼料(購自江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司,配方如下:基礎飼料68.1%、蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉10%、1.5%膽固醇、0.4%膽酸鹽)。各組大鼠分別飼養4周后禁食12小時,高脂飲食組大鼠一次性予30 mg/kg STZ(0.1 mol/L pH 4.0檸檬酸緩沖液配制,現配現用)腹腔注射,正常飲食組大鼠予30 mg/kg 檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射72小時后,尾靜脈采血測定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG),若FBG>11.1 mmol/L,即認為T2DM造模成功。高脂飼料組30只大鼠共建模成功24只T2DM大鼠,將其隨機分為模型組、新消渴方組、二甲雙胍組各8只,正常飲食組大鼠10只作為空白對照組。空白對照組、模型組予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃,二甲雙胍組和新消渴方組分別予鹽酸二甲雙胍片、新消渴方混懸液10 mL/kg灌胃,干預7周。

1.5 觀測指標

觀察給藥前后大鼠的一般情況,包括大鼠的精神狀態、毛色、攝食量、尿量。采用羅氏血糖儀及血糖試紙檢測各組大鼠FBG。采用空腹胰島素(fasting blood insulin,FINS)、SOD、GSH、MDA檢測試劑盒分別檢測FINS、SOD、GSH、MDA水平。采用胰島素抵抗指數(homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)評估IR,HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS (μU/mL)/22.5。采用全自動生化分析儀檢測肝功能、血脂四項[總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)]。各組大鼠進行葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test, OGTT)和胰島素耐量試驗(insulin tolerance test, ITT):各組大鼠干預7周末,隔夜禁食12小時,予40%葡萄糖溶液按照5 mL/kg體積灌胃,分別于空腹及糖負荷后30分鐘、60分鐘、120分鐘測定血糖值,繪制OGTT曲線,計算血糖曲線下面積(area under glycemic curve, AUC)。AUC=(0分鐘血糖+2×30分鐘血糖+3×60分鐘血糖+2×120分鐘血糖)/4]。ITT試驗:各組大鼠干預7周末,隔夜禁食10小時,經腹部皮下按照0.75 U/kg注射胰島素,分別于胰島素注射后0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘測定血糖值,計算ITT試驗下面積[AUC=(0.25×0分鐘血糖+0.5×30分鐘血糖+0.5×60分鐘血糖+0.25×120分鐘血糖)]。

1.6 肝臟指數、肝糖原定量及肝臟蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色

各組大鼠干預7周后禁食12小時,30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死,取下整個肝臟,稱重、計算肝脾指數。臟器指數=臟器重量(g)/體重(g)。各組分別從肝臟中葉相同部位迅速剪取部分肝組織,生理鹽水漂洗干凈,浸泡于10%福爾馬林中固定,一部分按照肝糖原定量試劑盒說明書行肝糖原定量檢測,一部分行肝組織HE染色。肝臟HE染色按照標準操作流程進行:將4%多聚甲醛固定的肝組織經梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,制成5 μm厚度切片。實驗前80℃烤片1小時,二甲苯脫蠟,梯度酒精至水,蘇木素染色,自來水洗滌,1%鹽酸酒精分化,0.6%氨水返藍,伊紅染色,梯度酒精脫水后二甲苯透明,用自動燈片機封片,用光學顯微鏡觀察并掃描圖片,放大倍數為200倍。

1.7 免疫蛋白印跡法(Western blot,Wb)法檢測肝臟組織蛋白表達水平

空白對照組、模型組、新消渴方組、二甲雙胍組每組選取3只大鼠,采用 Wb法檢測肝組織PI3K/AKT/FOXO1相關信號通路蛋白表達水平。肝臟組織預處理及細胞蛋白提取均在冰上或4℃進行。加入RIPA裂解液1 mL,冰上孵育30分鐘勻漿,12 000 r/min離心20分鐘,取上清,BCA法測定蛋白濃度并將各組濃度調平,蛋白樣品經凝膠電泳后轉移至PVDF膜,用封閉液按照1∶1 000比例稀釋一抗AKT、p-AKT(Ser473)、FOXO1、p-FOXO1(Ser256)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、PEPCK,4℃搖床過夜。一抗孵育結束,室溫下TBST洗膜3次,每次10分鐘。按照 1∶2 000比例稀釋山羊抗兔IgGHRP抗體,室溫孵育1小時,以TBST洗膜3次,每次10分鐘。ECL化學發光法顯影,采用ImageJ 1.52軟件進行蛋白條帶分析。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 新消渴方對T2DM大鼠FBG的影響

正常組大鼠毛發光澤,活動正常,對外界環境刺激反應靈敏;模型組大鼠毛發枯槁,多飲、多尿,行動遲緩,易驚易躁。與空白組比較,模型組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明顯升高(P<0.05)。各組藥物干預前(0周)FBG水平與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。新消渴方組、二甲雙胍片組分別干預4周、7周后FBG水平均較模型組明顯下降(P<0.05),各藥物干預組干預后FINS、HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 新消渴方對T2DM大鼠FBG的影響

2.2 新消渴方對T2DM大鼠葡萄糖耐量的影響

模型組大鼠第7周葡萄糖耐量實驗0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC明顯高于空白對照組(P<0.05)。新消渴方、二甲雙胍組干預7周后葡萄糖耐量實驗0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 新消渴方對T2DM大鼠葡萄糖耐量的影響

2.3 新消渴方對T2DM大鼠胰島素耐量的影響

ITT實驗胰島素注射30分鐘后各組大鼠血糖均降低。模型組大鼠各時點血糖及AUC均高于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較,各藥物干預組各時點血糖及AUC均明顯下降(P<0.05),ITT實驗注射120分鐘二甲雙胍組血糖明顯低于新消渴方組(P<0.05)。見表3。

表3 新消渴方對T2DM大鼠胰島素耐量的影響

2.4 新消渴方對T2DM大鼠血脂的影響

模型組TC、TG、LDL-C明顯高于空白對照組(P<0.05),HDL-C水平各組間差異無統計學意義(P>0.05)。新消渴方組、二甲雙胍組TC、TG較模型組明顯下降(P<0.05),LDL-C水平均與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 新消渴方對T2DM大鼠血脂的影響

2.5 新消渴方對T2DM大鼠氧化應激指標的影響

模型組T2DM大鼠SOD、GSH水平明顯低于空白對照組而MDA水平明顯高于空白對照組(P<0.05)。對比模型組,新消渴方組SOD、GSH水平明顯升高而MDA水平明顯降低(P<0.05);二甲雙胍組SOD水平明顯升高而MDA水平明顯降低(P<0.05),GSH水平較模型組升高但是與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 新消渴方對T2DM大鼠氧化應激指標的影響

2.6 新消渴方對T2DM大鼠肝糖原定量及臟器指數的影響

T2DM模型組大鼠肝糖原含量明顯低于空白對照組(P<0.05),新消渴方組、二甲雙胍組T2DM大鼠肝糖原含量明顯高于模型組(P<0.05)。T2DM模型組大鼠肝臟指數明顯高于空白對照組(P<0.05),新消渴方、鹽酸二甲雙胍干預7周后肝臟指數均明顯低于模型組大鼠(P<0.05)。脾臟指數各組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 新消渴方對T2DM大鼠肝糖原、肝臟指數、脾臟指數影響

2.7 新消渴方對T2DM大鼠肝臟形態的影響

空白對照組大鼠肝組織結構完整,肝小葉結構清晰,肝細胞以中央靜脈為中心向四周以放射狀整齊排列,肝竇規則,肝細胞索排列整齊。模型組大鼠肝細胞索排列紊亂,肝細胞多數腫脹,出現中到重度彌漫小泡性脂肪變性、空泡變性,胞漿內可見大小不等、數量不一的脂滴空泡,甚至部分肝細胞發生氣球樣、纖維化壞死。與模型組比較,各藥物干預組大鼠肝細胞排列較模型組均勻有序,細胞水腫及脂肪變性明顯減輕,見圖1。

注:A為空白對照組,B為模型組,C為新消渴方組,D為二甲雙胍組。

2.8 新消渴方對T2DM大鼠肝臟組織p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)、PEPCK、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達的影響

模型組較空白對照組p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達明顯下調(P<0.05),而PEPCK蛋白表達明顯上調(P<0.05)。新消渴方組、二甲雙胍組p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達明顯上調(P<0.05),而PEPCK蛋白表達明顯下調(P<0.05),見表7、圖2。

注: A為空白對照組,B為模型組,C為新消渴方組,D為二甲雙胍組。

表7 新消渴方對T2DM大鼠肝組織PI3K/AKT/FOXO1信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

DM屬于中醫消渴病范疇,消渴病病理機制為稟賦不足、飲食不節、情志失調、勞逸過度、外感邪毒致使陰虛燥熱,故養陰清熱是治療消渴病的重要治法[7]。朱震亨《丹溪心法》中的消渴方,由黃連、天花粉、人乳汁、藕汁、生地黃組成,葉天士《臨證指南醫案·三消》的消渴方,由生地、知母、石膏、麥冬、生甘草、生白芍組成,兩者皆是養陰清熱治療消渴病的重要方劑。國醫名師林蘭教授創立了DM陰虛熱盛型→氣陰兩虛型→陰陽兩虛型“三型辨證”理論,宏觀結合微觀將中醫辨證分型與胰島功能相關聯發現,陰虛熱盛型以IR為主,氣陰兩虛型以 IR 為主伴胰島功能損傷為主,陰陽兩虛型以胰島功能衰竭為主[8]。倪青教授師從林蘭教授,重視T2DM IR養陰清熱法的應用,結合多年臨床實踐經驗,對《丹溪心法》消渴方和《臨證指南醫案·三消》消渴方發展創新而成的新消渴方,方中黃連清熱解毒、防燥熱傷津,生地黃滋養肝腎,以治陰虛之本,二者合用養陰清熱共為君藥;知母、石膏清熱潤燥、養陰生津,麥冬、地骨皮滋陰清熱、退熱除蒸,助君藥養陰清熱為臣藥;白芍養血斂陰、柔肝止痛,防郁火灼傷肝津,甘草益氣健脾、防寒涼藥物傷胃,又可調和諸藥,共為佐使藥。全方共奏滋養肝腎陰津、清熱潤燥之功,用于治療T2DM陰虛熱盛證,收效頗佳[6]。

本研究結果發現,新消渴方組、二甲雙胍組大鼠精神狀態、活動狀況及“三多一少”癥狀較T2DM組大鼠明顯改善,這可能與高血糖狀態減輕有關。高胰島素血癥是T2DM 早期IR的重要標志,對比模型組,新消渴方組與二甲雙胍組FBG、FINS水平明顯降低,T2DM大鼠糖耐量明顯改善,還可明顯降低HOMA-IR水平、增加胰島素敏感性。T2DM常合并血脂代謝紊亂,后者對DM患者動脈粥樣硬化性心血管疾病影響最大,且與IR和胰島β細胞衰竭相關[9]。本研究發現消渴方組、二甲雙胍組TC、TG水平明顯低于模型組,提示新消渴方對脂代謝改善可能有益于減輕IR。氧化應激是由于機體受到刺激細胞中的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)產生過多和/或抗氧化防御機制減弱,致使ROS的生成和清除之間失衡。T2DM糖脂代謝異常、促炎因子等導致ROS產生過多造成氧化應激,同時使機體抗氧化應激能力下降,包括SOD、GSH降低而MDA升高,加重氧化應激損傷和胰島素信號傳導通路障礙,致使胰島β細胞損傷和加重T2DM IR[10-12]。研究顯示,新消渴方可明顯增加SOD、GSH水平,降低MDA水平,二甲雙胍組可顯著增加SOD水平而降低MDA水平,提高機體抗氧化應激能力可能有助于減輕IR及胰島β細胞損傷。T2DM常合并非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD),IR是兩者共同的病理基礎,IR可導致糖脂代謝紊亂、大量TG在肝臟沉積引起氧化應激及炎癥反應,促使NAFLD發生發展,同時NAFLD促使糖脂代謝異常、加重IR,促使T2DM并發癥發生[13]。新消渴方、二甲雙胍不僅能減輕T2DM大鼠糖脂代謝,還可以明顯改善肝臟組織脂肪變性,顯著降低肝臟指數、增加肝糖原含量,這可能對于改善T2DM大鼠肝臟IR有益。

肝臟通過調控肝糖異生和肝糖原合成以維持血糖穩態,肝臟IR是T2DM IR 的重要機制。AKT是調控肝臟糖代謝的重要蛋白,AKT(Ser473)磷酸化激活抑制肝糖異生和促進肝糖原合成[13]。PEPCK和GSK3β分別是調控肝糖異生和肝糖原合成的關鍵酶類,PEPCK過表達可導致肝糖異生增加,p-GSK3β(Ser9)表達下調可致糖原合酶(Glycogen synthetase,GS)GS磷酸化增強而抑制肝糖原合成[14-15]。AKT(Ser473)磷酸化激活后,使FOXO1磷酸化從細胞核轉至細胞質失活,從而抑制FOXO1在細胞核內與PEPCK DNA序列結合而啟動PEPCK基因表達;同時,AKT激活可通過 AKT/GSK3β信號通路,增加GSK3β(Ser9)磷酸化而抑制GS磷酸化而促進肝糖原合成[13-16]。研究顯示,模型組較空白對照組p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達明顯下調(P<0.05),而PEPCK蛋白表達明顯上調(P<0.05),提示T2DM大鼠肝臟IR與PI3K/AKT/FOXO1信號通路障礙有關。新消渴方組、二甲雙胍組p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達明顯上調(P<0.05),而PEPCK蛋白表達明顯下調(P<0.05),提示新消渴方可能通過激活T2DM大鼠PI3K/AKT/FOXO1信號通路,從而改善T2DM肝臟IR。

綜上所述,新消渴方可以改善T2DM大鼠糖脂代謝,減輕氧化應激,改善肝臟組織形態學,增加肝糖原含量,從而改善肝臟IR。新消渴方改善T2DM 肝臟IR的作用機制可能與其調控PI3K/AKT/FOXO1信號通路,激活相關蛋白表達有關。