振腹法對多囊卵巢綜合征大鼠血糖、胰島素水平及p38絲裂原活化蛋白激酶蛋白表達的影響

趙思雨 沈潛 付國兵 謝丹丹 李晶磊 李拓 趙峻嘹 齊恒 柏潔 耿楠

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種常見的女性生殖代謝內分泌紊亂疾病,主要臨床表現為肥胖、月經紊亂、高雄激素血癥、稀發排卵或無排卵、多毛、痤瘡等,多發于生育期女性,發病率為6%～10%,是導致女性不孕的主要原因,會增加女性患心腦血管疾病、婦科疾病、2型糖尿病及遠期并發癥的風險,嚴重影響患者的生命質量、生育及遠期健康。PCOS的發病機制尚不明確,因其臨床表現及治療療效的高度異質性,目前對于該病的診療仍未達成共識,大多數醫家認為本病由于下丘腦—垂體—卵巢軸功能出現紊亂導致。多囊卵巢綜合征患者的一大特點是內分泌紊亂,有研究表明,PCOS患者有更高的血糖異常率[1],患糖尿病風險更高,性激素、胰島素和血糖檢測能夠對多囊卵巢綜合征的臨床診斷提供非常重要的數據支持[2]。p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)主要參與細胞的分裂與增殖,在磷酸化過程中可促進其他胞質蛋白磷酸化,p38 MAPK可能是PCOS卵巢多卵泡發育的基礎,研究表明,PCOS卵巢粒細胞較于非PCOS卵巢粒細胞中,磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38 MAPK)表達量高[3]。振腹法是作用于腹部神闕穴的一種特色手法,研究表明,振腹法可以改善大鼠卵巢形態結構,降低性激素、炎癥因子表達水平,對PCOS大鼠有一定治療作用[4]?；谝陨锨疤?本研究應用振腹法對PCOS模型大鼠進行干預,探究振腹法治療對PCOS大鼠血糖水平的調節作用,及振腹治療對p38 MAPK蛋白表達與卵巢形態結構的影響,為振腹法治療PCOS的臨床應用提供基礎研究依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級SD雌性大鼠40只,6周齡,體質量(180±20) g,性成熟,未交配,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,生產許可證編號[SCXK(京)20166-0006]。屏障環境下室內溫度(23±1)℃,濕度(45±5)%,日光燈光照,普通清潔級鼠飼料飼養,自由飲用水。

1.2 主要試劑及儀器

實驗試劑:來曲唑:0.25 mg/片×10片/盒(國藥準字H19991001,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司),二甲雙胍:0.5 g/片×20片/盒(國藥準字H20023370,中美上海施寶貴制藥有限公司),1%羧甲基纖維素鈉溶液(Coolaber,批號:C9230),堿性美藍染液(泰科美生物科技有限公司),0.01 mol/L磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline, PBS),INS酶聯免疫檢測試劑盒(武漢云克隆有限公司,CEA448Ra),蛋白提取液(MDL,MDL91201),蛋白酶抑制劑(MDL,MD912893),BCA蛋白濃度測定kit(MDL,MD913053),SDS-PAGE預制膠套裝kit(MDL,MD911919),中等蛋白分子量marker(Thermo,26617),p38(Bioss,bs-1640R),p-p38(Bioss,bs-5477R),二抗(MDL,MD932485),75%酒精,2%戊巴比妥鈉。

實驗儀器:電子天平、移液槍、血糖儀(強生穩豪)、血糖試紙(強生穩豪)離心機(恒諾儀器 AXTGL16M)、微量加樣器(Gilson公司,法國)、電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設備廠,HWS-24)、PVDF膜(0.22 μm)(Millipore,美國,ISEQ00010)、3MM 濾紙(Whatman,英國,3030861)、脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司,TS-100)、電泳儀(北京百晶生物技術有限公司,BG-subMIDI)、低溫離心機(Sigma,德國,3-30K)、SDS-PAGE電泳系統(BIO-Rad,美國)、凝膠成像系統(UVP,美國,GelDoc-It310)、ChemiDoc MP化學發光成像系統(Bio-rad,美國,170-8280)、切片機(Leica RM2235)、石蠟包埋機(Leica G1150H)。

1.3 動物分組與造模

大鼠適應性飼養5天之后采用隨機數字表法分為空白組、模型組、二甲雙胍組、振腹組,每組10只。建立PCOS大鼠模型:選擇芳香花酶抑制劑造模法[5],來曲唑以0.125 mg/mL的濃度劑量溶于1%羧甲基纖維素鈉中,模型組、二甲雙胍組及振腹組大鼠連續以8 mL/(kg·d)的劑量灌服21天;空白組等濃度等體積羧甲基纖維素溶液連續灌胃21天。

模型建立成功的評定標準[6]:(1)陰道涂片:觀察大鼠陰道上皮細胞形態改變,監測動情周期。從造模第7天起直至造模第21天,每日上午8:00～9:00用生理鹽水浸潤的棉簽在大鼠陰道內順時針旋轉1圈后抽出,將大鼠陰道分泌物順時針旋轉均勻涂抹于載玻片上,95%酒精脫水、固定后,用堿性美藍染液染色5分鐘,顯微鏡下觀察上皮細胞形態。造模成功評價:涂片中上皮細胞持續1周以上以白細胞為主,未見陰道角化細胞,提示大鼠動情周期失常,且處于動情間期、無排卵。(2)血清T檢測,造模第21天晚7點禁食12小時,次日早上每組大鼠各隨機取1只大鼠處死,采腹主動脈動脈血,分離血清用于ELISA法檢測血清T水平,取卵巢組織觀察卵巢組織形態改變。造模成功評價:模型組、二甲雙胍組、振腹組大鼠血清T較空白組均顯著升高(P<0.05),卵巢組織較空白組出現多囊樣改變。符合以上2項,可確定造模成功,每組保留9只。

1.4 干預方法

空白組及模型組大鼠自由飲食、飲水。二甲雙胍組,實驗第22天起予二甲雙胍溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液,以二甲雙胍43 mg/(kg·d),1%羧甲基纖維素鈉溶液4 mL/(kg·d)的劑量灌服[7-8],連續給藥15天。振腹組大鼠實驗第22天起,同一操作者振腹手法干預,每只大鼠振腹治療后休息5分鐘后再進行下一只大鼠手法干預。具體干預操作如下:操作者左手固定大鼠,使大鼠腹部朝上,參照李忠仁[9]主編的《實驗針灸學》選取神闕穴。根據類比法,人手中指指腹面積與大鼠前爪面積近似相等,故選取右手中指置于大鼠神闕穴,進行振腹法操作,每只大鼠每次操作15分鐘,每天干預1次,連續干預15天。

最后1次干預后大鼠禁食12小時,腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg,大鼠昏迷后,腹主動脈取血4 mL,靜置30分鐘,放入多孔離心機中,3 000 r/min,4℃離心15分鐘,取上清液注入一次性EP管內密封,-80℃冰箱保存;取雙側卵巢,眼科剪去除輸卵管、卵巢表面脂肪組織及包膜,生理鹽水沖洗后紗布吸拭表面水分,分別將雙側卵巢用4%多聚甲醛固定及-80℃冰箱保存。

1.5 檢測指標

1.5.1 卵巢組織形態學觀察 4%多聚甲醛固定的卵巢進行脫水、石蠟包埋、切片,制作HE染色病理切片,光鏡下進行組織形態學分析。

1.5.2 空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、血清胰島素(fasting serum lisulin,FINS)、胰島素抵抗指數(homeostatic model assessment for insulin resistance,HOMA-IR) 取大鼠尾靜脈血,血糖儀測定FPG,取大鼠血清,采用酶聯免疫法測定FINS,嚴格按照試劑盒操作。

HOMA-IR=FPG水平×FINS水平/22.5

1.5.3 p38 MAPK蛋白表達 使用蛋白免疫印跡法對卵巢組織p38 MAPK蛋白表達進行測量。取大鼠卵巢組織,加液氮進行勻漿,加入1 mL PBS離心5分鐘。吸干殘留的PBS,估計樣品體積,加入5倍體積裂解液,混勻,冰浴中以最大功率超聲破碎細胞(3×10秒),4℃低溫離心機12 000 r/min離心15分鐘,取上清液。利用BCA法檢測蛋白總量。配膠、灌膠、上樣、電泳操作。以甲醇活化的PVDF膜進行轉膜,轉膜后小心取出轉移膜置于封閉液中,室溫、搖床上緩慢搖動狀態下封閉1小時。封閉后,加入一抗于4℃孵育過夜,用1×TBST洗滌PVDF膜3次,(室溫下緩慢搖動洗滌)每次10分鐘。將二抗用1×TBST稀釋300倍;將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中(室溫、避光緩慢搖動)作用60分鐘。用1×TBST洗膜,洗去游離二抗。按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中兩種液體;將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面,室溫作用4分鐘。抖掉膜上液體,將其放入化學發光成像系統成像。

1.6 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢組織形態學觀察比較

鏡下觀察各組大鼠卵巢組織切片,空白組可見正常卵母細胞、黃體,顆粒細胞層排列豐厚。模型組大鼠卵巢出現囊性卵泡,卵巢皮質間質細胞明顯增生,顆粒細胞層數減少。二甲雙胍組及振腹組大鼠卵巢形態與模型組相比,囊性卵泡減少,顆粒細胞層增厚,可見卵母細胞及少量黃體。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態學觀察(HE染色,×100)

2.2 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平比較

與空白組比較,模型組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR明顯升高(P<0.05),說明大鼠血糖水平升高,存在胰島素抵抗。與模型組比較,二甲雙胍組和振腹組大鼠的FPG、FINS、HOMA-IR水平顯著降低(P<0.05)。二甲雙胍組與振腹組相比較,FPG水平相近(P>0.05)。由此可見,振腹治療可以改善PCOS模型大鼠FPG、FINS水平,對PCOS伴胰島素抵抗有一定治療作用,且降低FPG水平效果與二甲雙胍相近。見表1。

表1 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比較

2.3 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達水平比較

與空白組比較,模型組大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平明顯較高(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組和振腹組的大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P<0.05)。二甲雙胍組與振腹組相比較,p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平相近(P>0.05)。由此可見,振腹治療可以降低p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平。見表2,圖2。

表2 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白相對表達量比較

圖2 各組大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達量比較

3 討論

根據PCOS的臨床表現及特點,中醫醫家將之歸為“月經后期”“月經量少”“閉經”“癥瘕”“不孕”等范疇。中醫認為本病的病機主要與腎虛、脾虛、肝郁、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮有關,同時認為本病病因以腎虛為本。腎虛體現在腎陽虛和腎陰虛兩方面。腎陽虛,腎陽不足,一則導致經血化生無力,二則腎的溫煦作用無力,不能推動血脈正常運行,血脈艱澀難行,故可見月經后期、月經量少、閉經等癥狀。腎陰虛,腎精不足,胞宮不得滋養,卵子發育成熟能力減弱,不能按期增殖及發育成熟,故可見卵巢組織細胞多空泡而無成熟卵細胞,致患者無孕。肝郁脾虛,血液滋養不足,致沖任損傷、天癸失序,血海不能充盈,導致患者出現月經推遲、閉經乃至不孕。脾虛生痰,痰瘀互結于胞宮,可見卵巢多囊樣改變;痰瘀泛溢四肢肌膚,致形體肥胖、多毛痤瘡等PCOS典型癥狀癥狀。本病中醫醫家治療多從腎、脾、肝論治。

振腹法治療PCOS以調理腎虛為本,兼治脾虛、肝郁,同時調節沖任,推行氣血津液,活血化瘀,重視先后天之本的調養與顧護。振腹療法是臧?？扑鶆摿⒓捌涞茏尤税l展而來,主要手法掌振法是以醫者手掌心勞宮穴正對患者腹部神闕穴,掌跟正對患者關元穴,中指對應患者任脈中脘穴,食指和無名指對應患者腎經,拇指和小指置于胃經,腕關節帶動手掌指間關節在腹部進行頻率為300～400次/分鐘的振動;操作幅度小、壓力適中、刺激量小,通過手與局部的共振傳導至深層組織和遠端,具有益氣健脾、溫陽散寒、和中理氣、調理沖任、寧心安神、交通心腎等功效,臨床中應用于內分泌、婦科、兒科、心血管等疾病的治療并取得良好療效[10]。神闕穴是振腹法治療PCOS的重要穴位。神闕穴具有培元固本、溫陽固脫、健脾益胃的功效,是神氣通行之門戶,先后天神氣在此處交匯并藏于此處,并通過沖、任、督、帶脈將全身經絡聯系在一起,為五臟六腑之本、十二經之根。通過振腹法刺激神闕穴,可激發腎中精氣、調理脾胃、顧護胃氣、暢通全身經絡,達到治療PCOS的作用。近年來,筆者將振腹法治療用于PCOS臨床治療,取得一定療效。

現代醫學認為,多囊卵巢綜合征,是一種多病因、多系統的女性生殖代謝內分泌紊亂疾病,主要臨床表現為肥胖、月經紊亂、高雄激素血癥、稀發排卵或無排卵、多毛、痤瘡等,多發于生育期女性,發病率為6%～10%[11]。PCOS與血糖、胰島素水平有密切關聯。PCOS患者有更高的血糖異常率,多數PCOS患者存在血糖升高的情況[1]。有研究表明,高胰島素血癥和胰島素抵抗對卵泡發育存在一定影響。PCOS高胰島素血癥使卵泡對卵泡刺激素的敏感性增加,反饋至垂體分泌的卵泡刺激素下降,導致卵泡提前閉鎖,形成無排卵[12]。另有研究表明,胰島素抵抗可以通過抑制肝臟合成胰島素樣生長因子結合蛋白,增加卵泡內膜細胞中的黃體生成激素,使非優勢卵泡提前閉鎖[13]。胰島素抵抗亦可直接作用于卵泡顆粒細胞,抑制卵泡的生長發育,阻礙排卵發生[14]。p38 MAPK信號通路與PCOS的發生發展存在密切關聯,p38是p38 MAPK信號通路參與細胞減數分裂、有絲分裂的重要信號蛋白[15],卵巢組織的p38 MAPK的磷酸化和過度表達會影響卵細胞的生長發育[3],促進卵巢的多囊樣變。p38作為MAPK信號通路的信號轉導分子,參與胰島素多種靶向器官的能量代謝[16],有研究表明,卵巢p-p38 MAPK蛋白表達增加,導致PCOS胰島素通路信號異常表達[17]。因此,p38 MAPK蛋白的表達與PCOS患者的發病、卵巢組織形態改變密切相關,同時影響PCOS患者血糖、胰島素水平。

本研究結果顯示,相比模型組大鼠,振腹組大鼠卵巢組織形態改善,FPG、FINS、HOMA-IR水平降低,FPG水平與二級雙胍組相近,表明振腹治療可以改善PCOS卵巢組織形態,調節PCOS大鼠血糖、胰島素水平,改善PCOS模型大鼠的胰島素抵抗狀態。相比模型組大鼠,振腹組、二甲雙胍組大鼠卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達量降低,說明振腹法可以改善卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平,進而改善PCOS癥狀;振腹治療可能通過降低p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達水平,調節PCOS血糖、胰島素水平,但其機制還需要進一步證明。

通過本研究,表明振腹治療能夠降低PCOS的FPG、FINS、HOMA-IR、卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平,改善卵巢組織形態,且在降低血糖的作用上與二甲雙胍相近。二甲雙胍是治療PCOS的重要藥物,可通過增加外周組織對葡萄糖的攝取利用,抑制肝糖異生和腸道葡萄糖的吸收,改善胰島素信號轉導,增加胰島素敏感性等途徑改善PCOS癥狀,PCOS伴胰島素抵抗的患者推薦使用二甲雙胍[18]。本研究為振腹法治療PCOS提供一定的科學依據,為進一步探討振腹調節p38 MAPK信號通路改善PCOS癥狀及血糖、胰島素水平的機制提供研究基礎。