膀胱癌患者癌組織ABCC4、miR-506-3p表達水平及臨床意義

廖高源,何 超,劉 攀

德陽市第二人民醫院泌尿外科,四川德陽 618000

膀胱癌是泌尿系統最常見的癌癥之一,其發病與內在遺傳因素及外在環境因素(如接觸芳香胺類物質等)有關,其在全球范圍內的死亡率和復發率較高,易復發和轉移,發現時往往已是晚期癌癥,可能導致預后不良[1]。臨床治療膀胱癌的方法很多,早期膀胱癌主要以膀胱切除術為主,晚期膀胱癌常采用綜合治療方案,包括放化療、免疫治療等,雖然膀胱癌的治療方法多樣,但患者近遠期的生存率仍較低。因此,尋找新的預后指標以調整膀胱癌治療方案是眼前的當務之急。超家族轉運跨膜蛋白ABC(ATP-binding cassette)可根據人類的序列同源性和系統進化發育分為7個亞家族,命名為ABCA到ABCG,其中,ATP結合盒轉運蛋白C4(ABCC4)是C型亞家族成員之一,也稱為多藥耐藥蛋白4(MRP4)[2]。研究顯示,ABCC4在多種人體組織表達,且與多種疾病的發生相關,被認為是一種新的有前景的治療靶點[3]。以往的研究表明,ABCC4在癌癥中發生異常表達,如ABCC4/MRP4在胰腺癌中表達上調,可促進胰腺腫瘤發生和轉移[4]。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA,通過以序列特異性方式抑制翻譯或切割降解靶基因mRNA轉錄來調節蛋白質編碼基因的表達。有報道顯示,miRNA的失調與癌癥發生發展有關,在膀胱癌組織已發現多個表達上調或下調的miRNA[5]。miR-506-3p是miRNA家族成員之一,定位于X染色體中,在多種癌癥中表達異常,有研究發現miR-506在膀胱癌細胞系中的表達水平降低[6],然而,ABCC4、miR-506-3p與膀胱癌患者預后的關系尚不明確。本研究通過檢測ABCC4和miR-506-3p的表達水平探討ABCC4、miR-506-3p與膀胱癌患者臨床病理特征、預后的關系,以期為尋找膀胱癌預后生物標志物和治療靶點奠定基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取的研究對象為本院2015年5月至2017年5月收治的78例膀胱癌患者,其中男55例、女23例,年齡在30～78歲、平均(55.26±4.21)歲。納入標準:經術前活檢和術后病理檢查診斷為膀胱移行細胞癌;接受根治性膀胱切除術;為浸潤性、多發性膀胱癌;臨床資料完整,可完成隨訪。排除標準:參與其他研究者;有語言交流障礙者;肝臟功能不全、存在其他免疫性疾病者。本研究獲得本院倫理委員會批準(審批號:20150402),所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測ABCC4 mRNA、miR-506-3p表達 術中收集所有患者膀胱癌組織及距離癌組織邊緣≥3 cm的癌旁組織迅速置于液氮中,轉移至-80 ℃保存備用。取50 mg組織參照Trizol試劑盒(貨號:CD-13433-ML,武漢純度生物科技有限公司)的方法提取總RNA,并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量濃度和完整度。將檢測合格的RNA按照Prime ScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa公司,貨號:RRO47AA)說明書進行逆轉錄得到cDNA。ABCC4和miR-506-3p的相對表達水平使用SYBR Green Master Mix(日本TaKaRa公司,貨號:RR420L)試劑盒和ABI7500型RT-qPCR儀(美國ABI公司)進行RNA檢測。PCR反應體系如下:SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL,引物F/R(10 μmol/L)各1 μL,cDNA模板(<100 ng)1 μL,加ddH2O至20 μL。反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,分別以GAPDH和U6作為內參基因,引物序列如下。ABCC4-F:5′-GGATCCAAGAACTGATGAGTTAAT-3′;ABCC4-R:5′-TCACAGTGCTGTCTCGAAAATAG-3′;miR-506-3p-F:5′-GACATGCATAAGGCACCCTTC-3′;miR-506-3p-R:5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′;GAPDH-F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′;內參基因GAPDH-R:5′-GGG TGTCGCTGTTGAAGT-3′;內參基因U6-F:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′;U6-R:5′-CAGGGGCCAT CCTAATCTT-3′。最終結果以2-ΔΔCt法計算,每組樣品重復3次。

1.2.2免疫印跡法檢測ABCC4蛋白表達 從組織提取蛋白質,采用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白,將蛋白轉移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉60 min;然后按照抗體說明書,采用相應的抗體進行孵育,兔抗人ABCC4單克隆抗體購自北京索寶生物科技有限公司(貨號:H00010257-K),山羊抗兔IgG(H+L)二抗購自碧云天生物技術公司(貨號:A0277)。以β-actin為對照,采用增強發光法觀察免疫印跡結果。使用Image J軟件對掃描圖像進行密度測定,以ABCC4/β-actin作為蛋白的相對表達水平。

1.2.3雙熒光素酶試驗 TargetScan Human網站搜索miR-506-3p靶基因,以pGL3為載體,根據搜索到的miR-506-3p與ABCC4的結合位點構建ABCC4突變型和野生型載體,將二者分別與miR-506-3p陰性對照和miR-506-3p mimic共轉染膀胱癌細胞系BIU-87細胞(深圳市豪地華拓生物科技有限公司,貨號:HTX2158C),轉染使用LipofectamineTM2000試劑按照其說明書操作,繼續培養24 h后消化、收集細胞,檢測雙熒光素酶相對活性,結果以熒光強度比值表示。

1.2.4ABCC4蛋白和miR-506-3p表達水平與臨床病理特征的關系 以膀胱癌組織ABCC4蛋白和miR-506-3p相對表達水平的平均值為臨界值將膀胱癌患者分為高表達組和低表達組,分析ABCC4蛋白和miR-506-3p表達水平與臨床病理特征的關系。

1.3隨訪 通過電話、短信、郵件和門診復查等方式對78例膀胱癌患者進行隨訪。隨訪開始時間為手術當日,第1、2年每3個月進行1次隨訪,第3、4年每6個月進行一次隨訪,隨訪結束時間為2021年5月或膀胱癌患者死亡。由專人記錄78例膀胱癌患者生存和死亡情況。隨訪率為100%,無失訪患者。

2 結 果

2.1膀胱癌組織和癌旁組織ABCC4 和miR-506-3p蛋白及mRNA表達水平比較 膀胱癌組織ABCC4蛋白和mRNA表達水平均明顯高于癌旁組織,而在膀胱癌組織miR-506-3p相對表達水平低于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1和圖1。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織ABCC4蛋白表達水平

表1 膀胱癌組織和癌旁組織ABCC4 mRNA蛋白和miR-506-3p水平比較

2.2膀胱癌組織ABCC4蛋白和miR-506-3p表達與臨床病理特征的關系 膀胱癌組織ABCC4蛋白表達與腫瘤分期、腫瘤最大徑和淋巴結是否轉移顯著相關(P<0.05),miR-506-3p表達與腫瘤分期有關(P<0.05),二者均與患者性別、年齡、吸煙、手術切緣無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 膀胱癌組織ABCC4和miR-506-3p表達與臨床病理特征的關系(n)

2.3膀胱癌組織ABCC4蛋白與miR-506-3p靶向及相關性分析 Pearson法相關性分析結果顯示,膀胱癌組織ABCC4蛋白水平與miR-506-3p的表達水平呈負相關(r=-0.549,P<0.05)。TargetScan Human網站搜索顯示,ABCC4為miR-506-3p的潛在靶基因,二者存在結合位點,見圖2。雙熒光素酶試驗結果顯示,相對于miR-506-3p陰性對照與ABCC4野生型載體,miR-506-3p mimic與ABCC4野生型載體的熒光素酶相對活性明顯降低(P<0.05);相對于miR-506-3p陰性對照與ABCC4突變型載體,miR-506-3p mimic與ABCC4突變型載體的熒光素酶相對活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 ABCC4和miR-506-3p的靶向結合位點

注:aP<0.05。圖3 熒光素酶相對活性比較

2.4ABCC4和miR-506-3p表達與膀胱癌患者預后的關系 隨訪統計結果顯示,78例膀胱癌患者中生存44例,死亡34例,總生存率為56.41%。使用Kaplan-Meier法分析ABCC4和miR-506-3p表達與患者總生存率的關系,Log-rank檢驗結果表明,ABCC4高表達組患者總生存率(38.46%)明顯低于低表達組(74.86%),差異有統計學意義(χ2=10.219,P<0.05);而miR-506-5p高表達組總生存率(71.79%)明顯高于低表達組(41.03%),差異有統計學意義(χ2=7.508,P<0.05)。見圖4。

注:A為ABCC4表達與患者總生存率的關系;B為miR-506-5p表達與患者總生存率的關系。圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析結果

2.5影響膀胱癌患者預后的危險因素分析 經SPSS22.0驗證發現,各變量間均不存在多重共線性(容差均>0.1,方差膨脹因子均<10)。COX單因素及多因素回歸分析結果顯示,腫瘤分期及膀胱癌組織ABCC4蛋白、miR-506-3p表達是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響膀胱癌患者預后的危險因素分析

3 討 論

膀胱癌是由于膀胱黏膜上發生惡性腫瘤引起的,分為非肌肉侵襲性腫瘤和肌肉侵襲性腫瘤,發病率極高,已經超越了前列腺癌,位于泌尿系統腫瘤疾病之首。盡管近幾年在膀胱癌治療方面取得了相當大的進步,但大多數晚期膀胱癌患者的化療效果一般,需要尋找新的預后指標和有效的治療策略,而了解影響膀胱癌發生發展的分子靶點可極大地改善其治療效果和病預后。

ABCCs/MRPs家族是一類跨膜轉運蛋白,家族成員中結構短的一部分保守性較低,其中ABCC4基因定位于人染色體13q32.1,是基因編碼最短的成員,參與各種組織的正常發育,同時其輸出的信號分子還能夠促進各種癌癥中的腫瘤生長,在腫瘤組織中的表達水平較高,ABCC4可介導化療藥物的外排,導致化療效果不佳[7-8]。近年來,ABCC4基因與人類腫瘤發生的關系及其作為多藥耐藥家族成員與腫瘤耐藥的關系越來越受到研究人員的關注。COLAVITA等[9]研究發現,與對照腎組織相比,MRP4在透明細胞性腎細胞癌中過表達,MRP4藥物抑制引起細胞阻滯,脂質成分改變,細胞質脂滴增加,最終導致細胞凋亡,為未來評估MRP4作為透明細胞性腎細胞癌可能的新治療靶點提供了的證據。一項關于膠質瘤的研究報告稱,ABCC4膠質瘤細胞中表達升高,可能在耐藥過程中起重要作用[10]。本研究結果表明,膀胱癌組織ABCC4 mRNA和ABCC4蛋白表達水平高于癌旁組織,且ABCC4蛋白表達與腫瘤分期、腫瘤大小和淋巴結轉移相關,表示ABCC4/MRP4可能在膀胱癌的發生發展中發揮作用。SAHORES等[4]的研究報道,在腺癌患者中,與MRP4表達水平較低的患者相比,MRP4表達水平較高的患者總體生存期往往較短,表明高水平的MRP4表達預示與預后不良相關。本研究通過分析ABCC4與膀胱癌患者預后的關系發現,ABCC4高表達患者總生存率明顯低于低表達患者,提示ABCC4表達水平變化可能與患者預后有關。另外,COX單因素和多因素分析結果顯示,ABCC4是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素,進一步提示ABCC4可能作為預測膀胱癌患者預后的指標之一。

miRNA是一類非編碼的RNA,主要通過結合mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)阻斷mRNA的翻譯或者降解mRNA。隨著對miRNA研究的不斷加深,研究人員發現miRNA可以作為不同類型癌癥的生物標志物,在癌癥的發生、發展和轉移中發揮重要作用。一些高表達的miRNA可能通過抑制腫瘤抑制因子而發揮致癌基因的作用,相反的,低表達的miRNA可能通過負調控癌基因而發揮腫瘤抑制因子的作用[11]。越來越多的研究報道,miRNA在膀胱癌組織與癌旁組織出現差異表達。郭宗華等[12]報道,miRNA-342在膀胱癌組織表達降低,與晚期臨床病理學特征和預后較差有關,可作為膀胱癌預后生物標志物。miRNA-145作為腫瘤抑制劑,在膀胱癌組織和細胞中表達下調,能夠抑制細胞的遷移和侵襲,可能成為膀胱癌的潛在生物標志物或治療靶點[13]。以往的研究證實了miR-506-3p在多種癌癥表達下調,具有抑癌作用。miR-506-3p在鼻咽癌中表達下調,過表達抑制了腫瘤生長和轉移[14]。卵巢癌組織miR-506-3p表達水平與癌旁非腫瘤組織相比也顯著下調,其過表達影響腫瘤細胞周期進展和細胞凋亡[15]。miR-506-3p在前列腺癌細胞中顯著低表達,其過表達能抑制腫瘤細胞的增殖[16]。與先前在鼻咽癌、卵巢癌和前列腺癌中的發現一致,本研究結果顯示,與癌旁組織相比,膀胱癌組織的miR-506-3p表達水平顯著降低,推測miR-506-3p可能參與了膀胱癌的發病過程。進一步分析發現miR-506-3p的表達與腫瘤分期有關,初步證實了miR-506-3p在膀胱癌的惡性進展中具有重要作用。

此外,本研究對miR-506-3p表達與膀胱癌患者預后的關系進行了分析,本研究結果發現miR-506-3p低表達組的總生存率明顯較低,且miR-506-3p表達與患者預后獨立相關,說明膀胱癌組織較低水平的miR-506-3p與患者預后不良有關,檢測miR-506-3p表達有利于評估膀胱癌患者的預后情況。

有研究表明,miRNA對癌癥組織廣泛表達的ABC轉運體具有調控作用[17]。生物信息學分析結果顯示,ABCC4被預測為miR-506-3p的靶向蛋白。同時,有文獻報道ABCC4為miR-506的直接靶標,它們之間呈反比關系[18]。本研究通過對膀胱癌組織ABCC4和miR-506-3p的表達水平進行相關性分析,發現二者表達水平呈負相關關系,且雙熒光素酶試驗結果顯示miR-506-3p與ABCC4具有靶向關系。基于以上研究,筆者推測膀胱癌中miR-506-3p可能通過靶向ABCC4發揮腫瘤抑制的作用,但具體機制需要進一步研究。

綜上所述,ABCC4在膀胱癌組織中表達上調,而miR-506-3p在膀胱癌組織中表達下調,二者表達與患者臨床病理特征和預后有關。本研究結果可為膀胱癌的早期診斷、治療和預后評估提供理論依據。但本研究仍存在缺陷,例如,僅著重分析了ABCC4和miR-506-3p表達情況及二者與患者預后的關系,未涉及體外實驗,在下一步的研究中將補充相關細胞實驗,繼續探討ABCC4和miR-506-3p在膀胱癌發生、發展中的作用。