早期自然流產患者絨毛組織中HO-1、MCP-1的表達及復發性自然流產的危險因素分析

龔國忠,程家亮,張孝廉,劉友迎,王昌明

1.遂寧市第一人民醫院檢驗科,四川遂寧 629000;2.遂寧市中心醫院輸血科,四川遂寧 629000

自然流產是指在妊娠28周以前非人為目的導致的終止妊娠,在妊娠12周前發生SA稱為早期自然流產(ESA)。研究顯示,自然流產發生率為12%,其中80%以上為ESA[1],多表現為停經一段時間后出現早孕反應,伴有陰道出血,輕微下腹疼痛。我國將3次及以上在妊娠28周前發生胎兒喪失定義為復發性自然流產(RSA)[2]。RSA病因復雜,除了目前臨床上已知的遺傳基因缺陷、內分泌失調、子宮解剖結構異常、感染、生殖免疫等常見因素外,仍有部分患者流產原因未明[3]。相關研究顯示,RSA風險隨流產次數增加而升高,每流產一次,再次流產風險將增加11%左右,3次及以上流產可將再次流產風險增加至40%,RSA不僅會損害育齡女性的身心健康,還對其家庭造成較大影響[4],故探討RSA的危險因素以指導臨床干預對保障育齡女性的生育健康需求有重要意義。有研究發現,血紅素氧合酶-1(HO-1)可能在母胎界面水平影響RSA的發生[5];單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)具有趨化性,能夠激活體內中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞的活性,產生大量細胞因子[6],也可能影響RSA的發生。鑒于此,本研究通過分析ESA患者絨毛組織中的HO-1、MCP-1表達情況,并探討RSA的危險因素,為臨床診療提供指導。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2021年5月遂寧市第一人民醫院(以下簡稱本院)收治的164例ESA患者作為ESA組,另選取同期在本院行人工流產的164例正常妊娠孕婦作為對照組。納入標準:(1)ESA組均符合《婦產科學》[7]中對ESA的診斷標準,既往自然流產史≤1次;(2)對照組術前B超可見胚芽及胎心搏動,月經規律,既往無流產史。排除標準:(1)因生殖細胞染色體異常、子宮發育異常、內分泌異常、感染及自身免疫性疾病而導致的流產者;(2)伴心臟病、高血壓等內外科疾病史者;(3)伴凝血功能異常者;(4)伴傳染性疾病者;(5)合并惡性腫瘤者;(6)因濫用藥物而導致流產者;(7)因腹部受到外因性的刺激和損害而致流產者;(8)放置宮內節育器者。

ESA組年齡24～35歲,平均(28.52±3.16)歲,孕周5～12周,平均(7.68±1.82)周,體重指數(BMI)20～28 kg/m2,平均(23.92±3.51)kg/m2,既往有自然流產史75例;對照組年齡23～36歲,平均(27.90±3.43)歲,孕周6～12周,平均(8.24±1.36)周,BMI 21～28 kg/m2,平均(23.80±3.14)kg/m2。兩組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會審核批準(審批號:201805-004)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理 清宮術或人工流產術后,在無菌條件下,采集自然流產和正常妊娠女性的流產絨毛組織,洗凈血液后,放入冷凍管中,-80 ℃保存,用于石蠟切片制備。

1.2.2絨毛組織HO-1、MCP-1蛋白表達檢測 取絨毛組織石蠟切片。常規脫蠟入水,枸櫞酸鹽緩沖液熱抗原修復,山羊血清封閉液封閉后滴加一抗、二抗(生物素標記)、鏈霉卵白素(堿性磷酸酶標記)各50 μL,37 ℃孵育25 min;DAB顯色15 min,沖洗,復染,脫水,封片。相關試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。根據染色強度記為0～3分,無染色為0分,棕黃色為3分;根據染色細胞陽性率記為0～4分,臨界值分別為25%、50%、75%。將兩項結果相乘,乘積<2分為陰性,≥2分為陽性。

1.2.3圖像分析 將免疫組化切片放置于Olympus顯微鏡下,對所測視野進行精準定位后由攝像系統提取數值化細胞圖像輸入CMIAS真彩色圖像分析系統,每張切片隨機選擇5個完整而不重疊的視野進行定量分析,根據免疫組化結果進行積分光密度(IOD)測定,計算平均IOD,以陽性染色細胞平均IOD作為HO-1、MCP-1表達水平。

1.2.4隨訪 采用電話或門診復診等方式對ESA組患者進行12個月的隨訪,隨訪期間連續發生3次及以上妊娠28周之前的自然流產判定為RSA。觀察統計ESA組患者發生RSA情況,將發生RSA的患者納入RSA組,未發生RSA的患者納入非RSA組。

1.2.5ESA患者RSA的影響因素分析 以ESA組患者年齡、孕周、BMI及HO-1、MCP-1表達水平等為自變量,對自變量進行賦值:年齡(實測值),孕周(實測值),BMI(<25 kg/m2=0,≥25 kg/m2=1),既往自然流產史(無=0,有=1),HO-1表達水平(實測值),MCP-1表達水平(實測值)。將RSA發生與否作為因變量(發生=0,未發生=1)。分析自變量與因變量的關系,記錄比值比(OR)。

2 結 果

2.1兩組HO-1、MCP-1陽性率及表達水平比較 ESA組HO-1陽性率及表達水平均低于對照組(P<0.05),ESA組MCP-1陽性率及表達水平均高于對照組(P<0.05)。見表1和圖1、2。

注:A為對照組絨毛組織中HO-1陰性表達;B為ESA組絨毛組織中HO-1陽性表達。圖1 絨毛組織HO-1表達情況(SP法,×100)

注:A為對照組絨毛組織中MCP-1陰性表達;B為ESA組絨毛組織中MCP-1陽性表達。圖2 絨毛組織MCP-1表達情況(SP法,×100)

表1 HO-1、MCP-1陽性率及表達水平[n(%)或

2.2RSA組和非RSA組患者臨床資料比較 ESA組患者在12個月的隨訪期間,有23例患者發生RSA,發生率為14.02%(23/164)。RSA組和非RSA組患者年齡、孕周、BMI比較,差異無統計學意義(P>0.05);RSA組的HO-1表達水平低于非RSA組(P<0.05),既往有自然流產史患者占比和MCP-1表達水平高于非RSA組(P<0.05)。見表2。

表2 RSA組和非RSA組患者臨床資料比較[n(%)或

2.3ESA患者RSA發生的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析結果顯示,既往有自然流產史、HO-1低表達、MCP-1高表達均為ESA患者RSA發生的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 ESA患者RSA發生的影響因素分析

3 討 論

妊娠是成功的半同種移植過程,胚胎能夠完全被母體接受并存活,說明母胎之間一定存在著免疫耐受[8]。ESA在臨床上較為常見,孕婦在孕早期多次發生自然流產后有發生RSA的風險,給育齡期孕婦身心及家庭帶來負擔。本研究結果顯示,ESA患者隨訪12個月內RSA的發生率為14.02%,稍低于既往葛怡琳[9]研究結果中的17%,可能與樣本量差異、個體差異等有關,但均表明ESA患者有發生RSA的風險。因此,需積極探討影響ESA患者發生RSA的影響因素,為臨床診治提供指導。

胚胎受母胎界面免疫反應的影響進入子宮內膜,改變其血管,使胚胎受到血液滋養,逐漸成熟,倘若免疫狀態失衡,胚胎將會出現血液供給不足,最終導致流產[10]。MCP-1通過參與免疫細胞的運動、遷移機制來影響胚胎期母胎界面的免疫反應[11-12]。絨毛組織中HO-l主要表達于胎盤功能的執行細胞,即滋養細胞,正常妊娠主要依靠滋養細胞功能和結構的完整性,HO-1不僅能夠加快生成膽紅素,還可將血紅素及其相關有害物清除[13],以減少多種應激損傷的發生。本研究結果顯示,ESA組MCP-1陽性率高于對照組,HO-1陽性率低于對照組,提示MCP-1陽性率升高、HO-1陽性率降低均與ESA的發生相關。原因可能是:母胎界面MCP-1表達上調可引起巨噬細胞的免疫活性異常,活躍的巨噬細胞分泌更多的MCP-1,促使大量巨噬細胞聚集,如此反復,從而導致胚胎死亡[14]。然而,HO-1陰性表達可能導致絨毛間的血紅蛋白和血紅素聚集,從而上調黏附分子表達,使免疫細胞被吸收,發生免疫排斥反應,最終導致ESA[15]。

RSA的病因較為復雜多樣,大部分患者病因難以識別,對廣大女性的生理、心理造成嚴重的影響,臨床上較為難防難治。本研究結果發現,RSA組患者的HO-1表達水平低于非RSA組,既往有自然流產史患者占比和MCP-1表達水平高于非RSA組,且多因素Logistic分析顯示這些均為RSA的影響因素。分析原因:自然流產可引起子宮內膜損傷和凝血異常,增加蛻膜發育不良、胎盤年齡等風險,影響再次妊娠。既往研究也證實流產次數越多,患者妊娠丟失率越高[16]。HO-1水平降低可破壞局部血管的舒張功能和滋養細胞功能,影響正常妊娠,造成胚胎組織種植穩固性較低,致使其發生脫落;同時,HO-1低表達可引起流入葉狀絨毛膜血流量降低,從而使胎盤內出現血氧不足,導致局部缺血絨毛壞死,胎盤內毒素因子增多,使得抗炎作用減弱和抗氧化能力不足,最終導致RSA的發生[17]。MCP-1可趨化單核-巨噬細胞等炎性細胞向病灶部位聚集,從而進一步加重機體損傷。MCP-1水平升高促進單核-巨噬細胞分泌前列腺素E2,增加宮縮,從而誘發流產。MCP-1可誘導炎性細胞靠近母胎界面,促進胎盤滋養細胞凋亡,子宮內膜功能層發生的短而直的小動脈突發急性狀況,引發胎盤出血、壞死等不良事件,最終導致流產[18]。

總之,妊娠本身是極其復雜的過程,本研究通過探討ESA患者絨毛組織HO-1、MCP-1表達情況及RSA發生的危險因素,證實了ESA患者絨毛組織HO-1表達水平降低、MCP-1表達水平升高,并且HO-1低表達、MCP-1高表達均會引起RSA的發生。因此,建議臨床上針對RSA患者監控上述指標水平,并積極采取措施進行治療。