基于NK細胞亞群與調(diào)節(jié)性T細胞的前列腺癌風險評估研究

馬權(quán)，陳永良，王楷峰，田偉

基于NK細胞亞群與調(diào)節(jié)性T細胞的前列腺癌風險評估研究

馬權(quán)，陳永良，王楷峰，田偉

紹興市中心醫(yī)院泌尿外科，浙江紹興 312000

探討自然殺傷（natural killer，NK）細胞亞群和調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細胞在前列腺癌患者外周血中的表達及其與前列腺癌的關(guān)系。選取2020年9月至2022年2月紹興市中心醫(yī)院收治的51例前列腺癌患者作為觀察組，52例同期健康體檢者作為對照組。采用流式細胞術(shù)檢測兩組患者外周血中NK細胞亞群和Treg細胞比例，分析不同TNM分期和Gleason評分的前列腺癌中NK細胞亞群、Treg細胞表達差異及相關(guān)性。觀察組CD56brightCD16-、CD56dimCD16+明顯小于對照組（<0.05），Treg細胞水平明顯大于對照組（<0.05）；不同TNM分期和Gleason評分的前列腺癌患者CD56brightCD16-、Treg細胞水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，CD56brightCD16-與前列腺癌TNM分期及Gleason評分呈負相關(guān)（<0.05），Treg細胞與前列腺癌TNM分期及Gleason評分呈正相關(guān)（<0.05）。CD56brightCD16-水平的下降以及Treg水平的升高，與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可能成為臨床評估前列腺癌惡性程度及判斷預后的特異性指標，為前列腺癌的診治提供新思路。

NK細胞；調(diào)節(jié)性T細胞；前列腺癌；免疫功能；流式細胞術(shù)

目前前列腺癌已成為我國男性泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，對男性健康造成嚴重威脅[1]。越來越多的研究表明，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫功能密切相關(guān)[2-3]。自然殺傷（natural killer，NK）細胞是具有直接殺傷功能的天然免疫細胞，主要分為CD56brightCD16–和CD56dimCD16+亞群，具有監(jiān)視惡性病變細胞的作用，構(gòu)成了機體抗腫瘤的第一道防線。CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細胞是具有免疫抑制能力的T細胞，既能防止人體產(chǎn)生自身免疫性疾病，又能促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[3]。目前，NK細胞亞群和Treg細胞與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展各階段關(guān)系的探討有限。本研究通過流式細胞術(shù)檢測，探究NK細胞亞群（CD56brightCD16–和CD56dimCD16+）和CD4+CD25+CD127lowTreg細胞在前列腺癌患者外周血中的表達情況及其與前列腺癌各階段的關(guān)系，以期為前列腺癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2020年9月至2022年2月紹興市中心醫(yī)院收治的51例前列腺癌患者作為觀察組，52例同期健康體檢者作為對照組，納入標準：①經(jīng)前列腺穿刺活檢確診為前列腺癌；②在檢查前未接受過前列腺癌相關(guān)治療。排除標準：①伴有急性或慢性炎癥；②患自身免疫性疾病或接受過免疫調(diào)節(jié)類藥物；③患有其他惡性腫瘤；④臨床資料不完整。本研究經(jīng)紹興市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準（倫理審批號：2023倫審論第004號），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

觀察組患者穿刺前抽取新鮮外周血，對照組人群體檢時空腹抽取新鮮外周血，兩組均以乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）抗凝。流式細胞儀：NovoCyte 2060R[安捷倫生物（杭州）有限公司]、DiagCyto[科技（浙江）有限公司]。檢測試劑：CD3、CD4、CD16、CD25、CD56、CD127檢測試劑及溶血素[科技（浙江）有限公司]。取抗體（不同項目加入不同抗體）加入流式管中，將混勻后的EDTA抗凝血樣本置于流式管底部，低速渦旋混勻，室溫下避光孵育15min。加入2ml（1×）UB Lysis solution置于流式管中，低速渦旋混勻，室溫下避光孵育15min。室溫下300×離心5min，棄去上清，加入2ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），低速渦旋混勻。室溫下300×離心5min，棄去上清，加入500μl 1%多聚甲醛。上機檢測，如無法立即檢測，將樣本放置在2～8℃下避光儲存（在細胞收獲/染色/裂解程序的24h內(nèi)完成），上機檢測前渦旋混勻。核查檢測項目包括NK細胞亞群（CD56brightCD16-、CD56dimCD16+）、Treg細胞（CD4+CD25+CD127low）。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。觀察組前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）、Treg大于對照組，觀察組CD56brightCD16–、CD56dimCD16+小于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（<0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較（）

2.2 觀察組不同TNM分期及Gleason評分患者NK細胞亞群及Treg細胞水平比較

觀察組不同TNM分期及GLeason評分患者CD56brightCD16–、Treg細胞比較，差異均有統(tǒng)計學意義（<0.05），不同TNM分期及GLeason評分患者CD56dimCD16+比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05），見表2、表3。

表2 不同TNM分期前列腺癌患者外周血中NK細胞亞群及Treg細胞水平比較（）

表3 不同Gleason評分前列腺癌患者外周血中NK細胞亞群以及Treg細胞水平比較（）

2.3 NK細胞亞群與Treg細胞水平與前列腺癌TNM分期及Gleason評分的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD56brightCD16–與前列腺癌TNM分期及Gleason評分呈負相關(guān)（<0.05），Treg細胞與前列腺癌TNM分期及Gleason評分呈正相關(guān)（<0.05），CD56dimCD16+與前列腺癌TNM分期及Gleason評分無顯著相關(guān)（>0.05），見表4。

表4 前列腺癌患者外周血中NK細胞亞群及Treg細胞水平與前列腺癌TNM分期及Gleason評分的相關(guān)性分析

3 討論

隨著人口老齡化、飲食習慣的改變，前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢，已成為男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。目前已有研究表明，適應性或先天性免疫細胞參與了前列腺癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移和治療[4]。因此，及時了解前列腺癌患者免疫狀態(tài)具有十分重要的意義。

NK細胞是一種先天性淋巴細胞，占循環(huán)淋巴細胞5%～20%，具有細胞毒作用和免疫調(diào)節(jié)功能，無需致敏，即可非特異性地識別并快速消滅腫瘤細胞，同時還能分泌細胞因子來促進適應性免疫抵抗腫瘤，在免疫監(jiān)視和免疫清除方面發(fā)揮重要作用。在人體內(nèi)，NK細胞由位于骨髓中的CD34+造血干細胞分化而來，主要特征為CD3-CD56+淋巴細胞群。根據(jù)CD56表達水平可分為CD56bright和CD56dim兩種亞型，CD56brightCD16-具有高分泌細胞因子的作用和較低的細胞毒性，而CD56dimCD16+具有更高的細胞毒性[5]。NK細胞抗腫瘤功能主要通過釋放穿孔素及顆粒酶裂解靶細胞、受體介導細胞凋亡、分泌各種細胞因子及通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用來實現(xiàn)。NK細胞數(shù)量及細胞活性的降低使得抗腫瘤能力弱化，進而導致機體患癌風險升高[6]。目前已有研究表明，較低的NK細胞活性與前列腺癌患病風險升高及術(shù)后切緣陽性密切相關(guān)，NK細胞水平的降低與前列腺癌進展呈正相關(guān)[7-9]。有研究基于外周血NK細胞亞群的變化建立機器學習模型預測前列腺癌患病風險，認為其可能成為前列腺癌診斷的新方法。Koo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌患者中NK細胞亞群CD56brightCD16–的減少可能先于NK細胞活性值的降低，且隨著病情加重，CD56brightCD16–水平也隨之逐漸降低，這或許是NK細胞功能障礙背后的機制之一。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌患者外周血中CD56brightCD16–、CD56dimCD16+明顯低于健康人群，且隨著前列腺癌的進展及Gleason評分的升高，CD56brightCD16–水平也隨之下降，這些NK細胞亞群的降低可能導致NK細胞活性降低，進而導致前列腺癌細胞發(fā)生免疫逃逸。

Treg是CD4+T細胞的一個亞群，具有抑制自身免疫及促進腫瘤細胞免疫逃逸的作用，目前認為CD4+CD25+CD127low是較理想的檢測Treg的分子表面標志。近年來研究顯示，在多種實體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了浸潤性Treg，其水平與腫瘤的進展和預后密切相關(guān)[11]。去除Treg細胞或封閉其抑制功能，可增強抗腫瘤免疫效應，提示機體可能處于一種免疫抑制狀態(tài)，更是Treg細胞參與腫瘤免疫逃逸的有力佐證[12]。2006年，Miller等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中的Treg細胞水平顯著升高，其具有免疫抑制作用，參與了早期前列腺癌的形成。Davidsson等[14]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中，Treg細胞水平往往與Gleason評分及病理分期呈負相關(guān)，并且Treg細胞的存在可能促使前列腺癌形成。此外，與健康人群相比，前列腺癌患者外周血中Treg細胞顯著升高，免疫抑制功能也更強[13，15-16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，前列腺癌患者外周血Treg細胞水平明顯升高，并且隨著前列腺癌的進展及Gleason評分的升高，Treg細胞水平也隨之升高，提示前列腺癌患者免疫功能失調(diào)與外周血Treg細胞水平升高有關(guān)，前列腺癌的發(fā)生、進展與機體免疫功能抑制有密切相關(guān)。

綜上所述，NK細胞亞群和Treg細胞能較好地反映前列腺癌患者免疫功能狀態(tài)，CD56brightCD16-和Treg參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，可能成為臨床評估前列腺癌惡性程度及判斷預后的特異性指標，為前列腺癌的診治提供新思路。但是本研究是回顧性研究，樣本量較小，存在一定的偏差，因此，NK細胞亞群和Treg細胞在前列腺癌外周血的表達及相關(guān)性有待于大樣本、多中心的研究進一步驗證。

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Prostate cancer risk assessment based on NK cell subsets and regulatory T cells

Department of Urology, Shaoxing Central Hospital, Shaoxing 312000, Zhejiang, China

To investigate the expression of natural killer (NK) cell and regulatory T (Treg) cell in peripheral blood of patients with prostate cancer and their relationship with prostate cancer.Fifty-one patients with prostate cancer who were admitted to Shaoxing Central Hospital from September 2020 to February 2022 were selected as the observation group, and 52 healthy subjects who underwent physical examination during the same period were selected as the control group. Flow cytometry was used to detect the proportion of NK cell subsets and Treg cell in peripheral blood of the two groups, and to analyze the difference and correlation of NK cell subsets and Treg cell expression in prostate cancer with different TNM stages and Gleason score.The levels of CD56brightCD16-and CD56dimCD16+in the observation group were significantly lower than those in the control group (<0.05), and the levels of Treg cell were significantly higher than those in the control group (<0.05). There were significant differences in CD56brightCD16-and Treg cell levels in prostate cancer patients with different TNM stage and Gleason score (<0.05). Spearman correlation analysis showed that CD56brightCD16-was negatively correlated with TNM stage and Gleason score (<0.05), while Treg cell was positively correlated with TNM stage and Gleason score (<0.05).NK cell subsets and Treg cell can better reflect the immune function of prostate cancer patients and are closely related to the occurrence and development of prostate cancer. They may become specific indicators for clinical evaluation of the malignancy degree and prognosis of prostate cancer, and provide new ideas for diagnosis and treatment of prostate cancer.

NK cells; Regulatory T cells; Prostate cancer; Immune function; Flow cytometry

R737

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.003

浙江省醫(yī)學會臨床科研基金項目（2019ZYC-A146）；柯橋區(qū)社發(fā)類經(jīng)費自籌科技計劃項目（2020KZ07）

陳永良，電子信箱：729917300@qq.com

（2023–01–12）

（2023–09–05）