2型糖尿病患者血清miR-146a與糖尿病腎病相關性研究

徐成高，羅麗君

2型糖尿病患者血清miR-146a與糖尿病腎病相關性研究

徐成高1，羅麗君2

1.嘉興市第一醫院內分泌科，浙江嘉興 314000；2.嘉興市第一醫院兒科，浙江嘉興 314000

探討2型糖尿病患者血清miR-146a及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與糖尿病腎病的關系。收集2020年12月至2022年1月嘉興市第一醫院內分泌科收治的128例2型糖尿病患者，根據尿白蛋白與尿肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）將患者分為3組：尿白蛋白正常組（UACR<30mg/g，58例）；微量尿白蛋白組（30mg/g≤UACR<300mg/g，44例）；大量尿白蛋白組（UACR≥300mg/g，26例）。收集患者的基線資料，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測血清miR-146a的表達水平，酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清TNF-α的表達水平。分析miR-146a及TNF-α與UACR的關系。與尿白蛋白正常組相比，微量尿白蛋白組和大量尿白蛋白組患者的TNF-α水平均明顯升高，且隨尿蛋白升高遞增，差異有統計學意義（<0.05）。微量尿白蛋白組和大量尿白蛋白組患者的miR-146a水平均低于尿白蛋白正常組，差異有統計學意義（<0.05）。Spearman相關分析顯示，miR-146a與UACR呈負相關（=–0.574，<0.05），TNF-α與UACR呈正相關（=0.824，<0.05）。miR-146a預測糖尿病腎病的敏感度為77.1%，特異性為79.3%（95%：71.7%～87.4%，<0.05）。2型糖尿病患者血清miR-146a及TNF-α可作為預測糖尿病腎病的分子學標志物，有助于糖尿病腎病的早期診斷。

2型糖尿病腎病；miR-146a；TNF-α

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者中常見的慢性微血管并發癥。研究報道，在糖尿病病程15年以上人群中，終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）發病率超過20/1000人年，DN是目前引起ESRD的首要原因[1]。目前我國DN的發病率呈不斷上升趨勢，住院患者中有40%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者罹患有DN。目前研究表明，DN的風險因素包括高齡、男性、種族、長病程、高血糖、高血壓、肥胖（尤其是腹型肥胖）、高鹽飲食、血脂異常、腎毒物質、急性腎損傷、蛋白攝入過多等，然而T2DM患者DN的具體發病機制仍不完全清楚[2-3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼RNA分子。miR-146a是與炎癥反應密切關聯的miRNA，其作為調控因子可參與天然免疫，其影響細胞代謝主要是通過影響核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）相關通路的靶基因調控炎癥反應實現[4]。研究發現，T2DM患者血清miR-146a水平較健康者普遍降低，miR-146a表達水平降低與T2DM的易感性有關[5]。另有研究表明，T2DM合并周圍神經病變組中，miR-146a表達水平明顯低于T2DM組，并證明miR-146a不依賴血糖水平在糖尿病周圍神經病變中發揮重要作用[6]。在動物實驗中發現，miR-146a靶向腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）調節白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子的分泌，糖尿病小鼠血清中miR-146a水平下調，促進了炎癥的活化及腎臟纖維化基因的表達[7]。目前miR-146a與DN的研究報道較少，因而本研究為探討miR-146a與T2DM患者DN的關系，通過對2020年12月至2022年1月嘉興市第一醫院內分泌科收治的128例T2DM患者的臨床資料進行回顧，根據DN的臨床診斷指標UACR的不同分組分析，探討miR-146a對DN的早期診斷價值，以對診治DN提供重要參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年12月至2022年1月嘉興市第一醫院內分泌科收治的128例T2DM患者。納入標準：①年齡為18～70歲；②參照1999年WHO發布的《2型糖尿病診斷標準》；③未服用增加或減少尿白蛋白的藥物，如血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑和鈉–葡萄糖協同轉運蛋白2（sodium- dependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制劑；④臨床資料相對完整。排除標準：①其他原發或繼發腎臟疾病；②嚴重心臟疾病、血液病、腫瘤疾病；③感染性疾病；④未控制的高血壓等。根據尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）將患者分為3組：尿白蛋白正常組（UACR<30mg/g，58例）；微量尿白蛋白組（30mg/g≤UACR<300mg/g，44例）；大量尿白蛋白組（UACR≥300mg/g，26例）。本研究征得患者的知情同意，并經嘉興市第一醫院倫理委員會審核批準（倫理審批號：LS2018-192）。

1.2 方法

1.2.1 收集基線資料 包括患者的性別、年齡、病程、吸煙史、收縮壓、舒張壓、體質量、身高。

1.2.2 實驗室指標測定 采集患者清晨空腹靜脈血，采用全自動生化儀電化學發光法測定甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、肌酐、尿素氮、空腹血糖水平。化學發光法測定空腹胰島素、維生素D水平，高壓液相色譜法測定糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平，留取晨尿采用免疫投射比濁法測定UACR。穩態模型評估的胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）=胰島素（mIU/L）×葡萄糖（mmol/L）/22.5。

1.2.3 血清TNF-α的測定 收集患者血液標本，3000r/min（離心半徑10cm）離心10min，分離取上清，置于–80℃冰箱保存。采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清TNF-α的表達水平。選擇DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀（美國Thermo公司）在450nm處測定吸光度，根據標準曲線，計算TNF-α的濃度。

1.2.4 miR-146a的測定 收集患者血液標本，3000r/min（離心半徑10cm）離心10min，分離取上清，置于–80℃冰箱保存。采用Trizol提取miRNA，采用miRNA反轉錄試劑盒合成cDNA，采用Platinum?Taq DNA Polymerase-PCR試劑盒檢測血清miR-146a水平，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行，miRNA提取試劑盒貨號A33252購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，miRNA反轉錄試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，Platinum?Taq DNA Polymerase（PCR）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。反應體系20μl，反應條件：95℃ 5s；60℃ 40s；共40個循環。每份樣品設3個重復，取平均值。miR-146a及內參U6的引物序列見表１。采用２–△△CT法分析miR-146a的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組基線資料比較

各組患者間年齡、體質量指數、性別、糖尿病病程、吸煙構比比較，差異均無統計學意義（>0.05）。大量尿白蛋白組患者的收縮壓高于尿白蛋白正常組，差異有統計學意義（<0.05）。見表2、表3。

2.2 實驗室指標、炎癥因子及miR-146a的比較

各組患者間空腹血糖、LDL-C、TG、HDL-C、TC、維生素D及HOMR-IR比較，差異均無統計學意義（>0.05）。微量尿白蛋白組和大量尿白蛋白組患者的肌酐、尿酸及TNF-α水平均高于尿白蛋白正常組（<0.05），且呈遞增趨勢。微量尿白蛋白組較尿白蛋白正常組HbA1c更高（<0.05）。微量尿白蛋白組和大量尿白蛋白組患者的miR-146a水平低于尿白蛋白正常組（<0.05），呈遞減趨勢，見表3～表5。

表2 各組患者的性別、吸煙、糖尿病病程、年齡及體質量指數比較

表3 各組患者的收縮壓、肌酐、尿酸、維生素D及LDL-C比較

注：1mmHg=0.133kPa；與尿白蛋白正常組比較，#<0.05；與微量尿白蛋白組比較，△<0.05

表4 各組患者的HDL-C、TC、TG及HbA1c比較

注：與尿白蛋白正常組比較，*<0.05

表5 各組患者的HOMA-IR、空腹血糖、TNF-α及miR-146a比較

注：與尿白蛋白正常組比較，*<0.05；與尿白蛋白正常組比較，#<0.05與微量尿白蛋白組比較，△<0.05

2.3 UACR、血清miR-146a水平與其他指標的相關性

UACR與糖尿病病程、HbA1c、收縮壓、TC、肌酐、尿酸及TNF-α呈正相關（分別為0.182、0.254、0.263、0.202、0.313、0.280、0.824，均<0.05），與miR-146a呈負相關（=–0.570，均<0.05）。miR-146a與收縮壓、肌酐、UACR及TNF-α呈負相關（分別為–0.233、–0.254、–0.574、–0.538）。

2.4 UACR的影響因素

以UACR為因變量，以糖尿病病程、收縮壓、肌酐、尿酸、總膽固醇、HbA1c、miR-146a、TNF-α為自變量，建立多因素Logsitic回歸分析模型，研究各指標與UACR間的關系。多因素Logsitic回歸分析結果顯示，糖尿病病程、肌酐、miR-146a、TNF-α為UACR的獨立相關因素，見表6。

表6 UACR影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 miR-146a對DN的預測價值分析

miR-146a預測發生DN（UACR>30mg/g）的AUC為0.796±0.040，其預測DN的敏感度為77.1%，特異性為79.3%（95%：71.7%～87.4%，<0.05），見圖1。

圖1 miR-146a對糖尿病患者發生糖尿病腎病（UACR>30mg/g）的預測價值

3 討論

DN的診斷包括病理診斷和臨床診斷，目前多以臨床診斷為主，盡管DN早期可表現為尿白蛋白陰性，臨床癥狀不顯著，但目前UACR仍是可靠敏感的DN的早期檢測指標。因此，可早期通過UACR及時發現DN，預防與延緩其發生、發展，從而改善糖尿病患者的生活質量[8]。miR-146a定位于第5號染色體第2外顯子，其可參與炎癥反應、胰島素抵抗、促炎因子等過程。研究發現，miR-146a通過NF-κB的反饋環路在固有免疫和適應性免疫中發揮重要作用[9-10]。在大鼠模型中，miR-146a通過抑制NF-κB信號通路，使其下游IL-1β等炎癥因子的釋放減少，減少細胞凋亡，從而對腎臟發揮保護作用[11]。另有基礎研究表明，miR-146a可通過M2巨噬細胞的極化發揮腎臟保護作用[12]。國外報道顯示，miR-146a rs2910164是糖尿病神經病變的易感基因，CC基因型和C等位基因增加了T2DM的患病風險[13]。王國風等[14]研究認為，miR-146a基因多態性增加了糖尿病神經病變的風險。杜菲菲等[15]發現，miR-155及miR-146a水平在糖尿病患者中顯著低于健康對照人群。以上臨床及基礎研究表明，miR-146a可能通過減輕炎癥反應降低糖尿病及DN的發生風險。

本研究通過單因素組間分析發現，隨著UACR的升高，TNF-α水平上升及miR-146a下降。相關分析發現，UACR與糖尿病病程、收縮壓、甘油三酯、肌酐、尿酸及TNF-α呈正相關，與miR-146a呈負相關，同時相關分析發現，miR-146a與收縮壓、肌酐、UACR及TNF-α呈負相關。進一步通過多因素Logistic回歸性分析后可見，miR-146a對DN的影響獨立于血糖、血脂之外，其表達水平與UACR的水平密切相關。結合Bhatt等[7]的動物試驗研究推測T2DM患者miR-146a水平下降通過靶向TRAF6基因促進TNF-α等炎癥因子的分泌，促進DN的發生、發展。另外，ROC曲線分析結果表明，利用miR-146a預測DN，其敏感度和特異性均較高，可作為診斷DN的標志物。目前DN早期診斷發現是臨床面臨的重要問題，越早發現DN高危人群并積極地干預可延緩其進一步的發生、發展，避免患者病情的加重及生活質量的受損。miRNA的深入研究可更好地探究糖尿病及其并發癥的發病機制，可作為高危人群新的標志物，為糖尿病的診斷、治療及預防提供新的方向。

綜上所述，T2DM患者血清中miR-146a的降低，可能通過TNF-α等炎癥因子的升高介導T2DM患者的腎臟損傷，miR-146a可能成為DN早期的血清標志物。但本研究也存在局限性：本研究為觀察性研究，需要今后前瞻性、更大樣本的研究進一步論證miR-146a對糖尿病及DN的早期發現及病情嚴重程度的影響。

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Correlation between serum miR-146a and diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes mellitus

XU Chenggao, LUO Lijun

1.Department of Endocrinology, the First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314000, Zhejiang, China; 2.Department of Pediatrics, the First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314000, Zhejiang, China

To investigate the relationship between miR-146a, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes mellitus.A total of 128 patients with type 2 diabetes mellitus admitted to the Department of Endocrinology, the First Hospital of Jiaxing from December 2020 to January 2022 were collected. According to the urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR), the patients were divided into three groups: urinary albumin normal group (UACR<30mg/g, 58 cases); microalbuminuria group (30mg/g≤UACR<300mg/g, 44 cases); macroalbuminuria group (UACR≥300mg/g, 26 cases). The baseline data of all patients were collected, the expression level of serum miR-146a was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the expression level of serum TNF-α was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The relationship between miR-146a, TNF-α and UACR was analyzed.Compared with the urinary albumin normal group, the level of TNF-α in the microalbuminuria group and macroalbuminuria group were significantly increased, and showed an increasing trend, the differences were statistically significant (<0.05). The level of miR-146a in the microalbuminuria group and macroalbuminuria group were lower than those in urinary albumin normal group, and the differences were statistically significant (<0.05). Spearman correlation analysis showed that miR-146a was negatively correlated with UACR (=–0.574,<0.05), and TNF-α was positively correlated with UACR (=0.824,>0.05). The sensitivity and specificity of miR-146a in predicting diabetic nephropathy were 77.1% and 79.3% (95%: 71.7%-87.4%,<0.05).Serum miR-146a and TNF-α in patients with diabetic mellitus can be used as molecular markers to predict diabetic nephropathy and contribute to the early diagnosis of diabetic nephropathy.

Type 2 diabetic nephropathy; MiR-146a; TNF-α

R587

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.010

浙江省嘉興市科技計劃項目（2019AD32172）

羅麗君，電子信箱：m18660927939@163.com

（2023–08–30）

（2023–09–05）