基于TARGET數據庫篩選兒童急性髓細胞白血病的關鍵基因和信號通路

鄧穎，熊安秀，劉景珍，祁閃閃，熊昊

（1. 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院公共衛生科，武漢 430015； 2. 宜昌市中心人民醫院兒科，湖北 宜昌 443003； 3. 恩施州中心醫院兒童血液消化心血管腎病中心，湖北 恩施 445099； 4 .華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院兒童血液疾病研究室，武漢 430015； 5.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院血液腫瘤科，武漢 430015）

急性髓細胞白血病 （acute myeloid leukemia，AML）約占兒童白血病的20%～25%［1］。雖然與急性淋巴細胞白血病相比，兒童AML的發病率低，預后較差。目前，AML的總生存率不到70%，復發率高達25%～35%［2-3］。細胞遺傳學被認為是AML風險分層的主要依據，然而在臨床實踐中，接近半數的AML患兒細胞遺傳學正常，疾病的轉歸卻有著顯著的差異［4］。近年來，隨著二代基因測序技術的發展，AML相關的重現性遺傳學異常逐漸被發現，并且在AML診斷、治療和預后等方面的重要性日益凸顯，但仍有部分患兒未攜帶已知的遺傳學異常。因此，探究與兒童AML相關的新的分子生物標志物有助于對AML患兒進行風險分層。本研究通過下載和整理有效治療方法適用性研究 （therapeutically applicable research to generate effective treatments，TARGET） 數據庫中兒童AML的基因表達數據和臨床信息，利用生物信息學分析手段對AML相關的致病基因進行挖掘，以期為探索AML的發病機制及分子標志物的篩選提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 基因表達數據信息

通過TARGET網站 （https：//ocg.cancer.gov/programs/target） 檢索并下載兒童AML的臨床信息和基因表達數據。TARGET數據庫包含121例AML患兒的臨床信息，其中，女性患兒63例，男性患兒58例。TARGET數據庫中AML患兒的基因表達數據和臨床信息來自美國兒童腫瘤協作組 （children’s oncology group，COG） 的美國AML （America acute myeloid leukemia，AAML） 0531 Ⅲ期臨床試驗。

1.2 差異表達基因的篩選

采用R軟件的DESeq2包對TARGET數據庫AML患兒的基因表達數據進行差異表達基因篩選，篩選條件為差異表達上調或下調≥2倍，即 | log2FC |≥1，且P< 0.05。

1.3 差異表達基因的生物信息學分析

采用DAVID在線數據庫對篩選出的差異基因進行基因本體論 （Gene Ontology，GO） 注釋和京都基因與基因組數據庫 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 信號通路注釋，分析差異基因參與的生物學過程（biological process，BP） 以及涉及的相關通路，以P< 0.05 為入選標準。應用STRING在線數據庫構建差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡結構圖，然后使用Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化，并通過cytoHubba插件篩選hub基因。

1.4 樞紐（hub）基因的驗證

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。使用R語言的survival包計算hub基因表達量的最佳cut-off值，并將表達量

2 結果

2.1 差異基因的篩選

TARGET數據庫中有121例AML患兒的臨床信息，除7例危險度分層未知外，其余114例患兒中48例低危，61例中危，5例高危。進一步對114例患兒初診時骨髓標本的基因表達信息進行分析。相較于低?；純海懈呶；純河? 092個差異基因，其中上調基因1 167個，下調基因925個 （圖1A）。相較初診患兒，39例復發患兒有785個差異基因，其中上調基因184個，下調基因601個 （圖1B）。繪制2組差異基因的韋恩圖，共得到差異基因96個，其中上調基因38個（圖1C），下調基因58個 （圖1D）。

圖1 TARGET數據庫AML患兒差異基因的篩選Fig.1 Screening of DEGs of childhood AML using the TARGET database

2.2 差異基因的GO富集分析和KEGG富集分析

采用DAVID數據庫對96個差異基因進行GO富集分析。結果顯示，差異基因在細胞組分 （cellular component，CC） 主要富集于核小體、細胞質、晚期內體膜、核染色體、濃縮染色體外著絲粒，在BP中主要富集于核小體組裝、染色體分離、對有毒物質的反應、染色質沉默、紡錘組織，在分子功能 （molecular function，MF） 主要富集于蛋白質異二聚活性、DNA結合、染色質結合、微管結合、MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，見圖2A。96個差異基因的KEGG通路富集分析結果顯示，差異基因在酗酒、系統性紅斑狼瘡、病毒致癌等通路聚集，見圖2B。

圖2 差異基因的富集分析Fig.2 Enrichment analysis of DEGs

2.3 分析與AML相關的hub基因

通過 STRING 數據庫構建96個差異基因的PPI網絡 （圖3A）。除去孤立無關系的蛋白節點，通過Cytoscape 軟件對差異基因進行PPI 網絡的可視化（圖3B），顏色越紅，關聯性越強。在Cytoscape 軟件的cytoHubba模塊，分別使用Betweenness、EPC、MCC、Radiality、Stress等5種計算方法計算 PPI 網絡節點的前10個有較高連接度的hub基因，見表1。得到的15個hub基因分別是細胞分裂周期相關蛋白2 （cell division cycle associated 2，CDCA2）、細胞周期蛋白依賴激酶1 （cyclin dependent kinase 1，CDK1）、著絲粒蛋白E （centromere protein E，CENPE）、DNA甲基轉移酶3B （DNA methyltransferase 3 beta，DNMT3B）、二肽基肽酶4 （dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、核酸外切酶1 （exonuclease 1，EXO1）、TTK蛋白激酶 （TTK protein kinase，TTK）、FOS原癌基因 （Fos proto-oncogene，FOS）、H2B聚集組蛋白5 （H2B clustered histone 5，H2BC5）、H3聚集組蛋白4 （H3 clustered histone 4，H3C4）、H3聚集組蛋白10 （H3 clustered histone 10，H3C10）、H2A聚集組蛋白19 （H2A clustered histone 19，H2AC19）、H2A聚集組蛋白20 （H2A clustered histone 20，H2AC20）、H2B聚集組蛋白21 （H2B clustered histone 21，H2BC21）、轉化生長因子β1誘導轉錄1（transforming growth factor beta 1 induced transcript 1，TGFB1I1）。

表1 5種計算方法的前10個hub基因Tab.1 The top 10 hub genes identified by five centrality methods

圖3 差異基因的PPI分析Fig.3 PPI analysis of DGEs

2.4 hub基因與AML患兒臨床病理特征的相關性

采用χ2檢驗分析AML患兒臨床病理特征 （包括性別、年齡、初診時外周血白細胞、中樞浸潤、危險度分層） 與15個hub基因表達量之間的相關性。結果表明hub基因的表達與男女比例、年齡分布、是否中樞侵犯等無相關性 （均P> 0.05）。DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1的高表達與危險度分層呈正相關 （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20的高表達與危險度分層呈負相關 （均P< 0.05）。DPP4、CENPE、TTK、CDCA2基因高表達組患兒初診時外周血WBC高于低表達組 （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、H2BC5、H2AC20基因高表達組患兒初診時外周血白細胞低于低表達組（均P< 0.05），DNMT3B、EXO1、CDK1、TGFB1I1基因高表達組和低表達組患兒初診時白細胞計數無統計學差異 （均P> 0.05）。

2.5 hub基因與AML患兒預后的關系。

對15個hub基因進行單因素Cox回歸分析，結果顯示，DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1等基因的高表達和H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20等基因的低表達是影響AML患兒總生存期的危險因素。對以上因素進行多因素Cox比例風險模型分析，結果顯示，15個相關聯的hub基因中DNMT3B的高表達、DPP4的高表達、CENPE的高表達、H3C10的低表達是AML患兒總生存期的獨立危險因素，見表2。

表2 hub基因的單因素和多因素分析構建預后風險模型Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analyses of the hub genes for constructing prognostic risk models

3 討論

本研究通過分析TARGRT數據庫AML患兒的基因表達數據，篩選出與危險度分層和復發相關的96個差異基因。GO和KEGG富集分析結果顯示，差異基因編碼的蛋白主要富集于細胞核和細胞質，參與的BP主要有DNA結合、核小體組裝、染色體分離等。

在篩選出的hub基因中，DNMT3B與DNA甲基化的相關。DNMT3B負責DNA的從頭甲基化。雖然在AML中DNMT3B的突變很少見，但DNMT3B的高表達預示著高耐藥率和高復發率［5-6］。髓過氧化物酶 （myeloperoxidase，MPO） 是診斷AML的生物標志物，其高表達與更好的預后相關。據報道，DNMT3B可以上調AML細胞MPO啟動子的甲基化，抑制MPO的表達。而且DNMT3B對MPO啟動子的甲基化不受AML常見突變 （FLT3-ITD、CEBPA或NPM1突變） 的影響［7］。此外，DNMT3B高表達導致DNA超甲基化在T細胞急性淋巴細胞白血病和伯基特淋巴瘤中也有報道［8］。

DPP4表達于骨髓來源的細胞、骨骼肌細胞、血管平滑肌細胞和脂肪細胞等［9-11］。在慢性白血病，尤其是慢性B淋巴細胞白血病中，有大量研究［12-14］證明了DPP4的促癌作用。DPP4的表達影響臨床分期、治療緩解所需時間、總生存期、無病生存期，是負性的預后因素。雖然急性白血病樣本中，包括T細胞急性淋巴細胞白血病、B細胞急性淋巴細胞白血病和AML，白血病細胞膜DPP4的表達量與非白血病患者無差異，但白血病患者血漿sCD26/DPP4明顯高于非白血病患者［15］。

CENPE、CDCA2、CDK1、TTK、EXO1、FOS與細胞周期、細胞增殖密切相關。在AML中，CDK1的促癌作用相對明確，但關于CENPE、CDCA2、TTK、EXO1、FOS的報道較少。H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10是組蛋白H2和H3的成員，是構成核小體的重要組成部分。目前，關于TGFB1I1、H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10在AML致病機制中的作用少有報道。

綜上所述，本研究通過對TARGET數據庫AML患兒初治時低危組與中高危組的骨髓差異基因、初治時與復發時骨髓差異基因的綜合分析，發現CDCA2、CDK1、CENPE、DNMT3B、DPP4、EXO1、TTK、FOS、H2BC5、H3C4、H3C10、H2AC19、H2AC20、H2BC21和TGFB1I115個與兒童AML相關的hub基因。這15個基因均與預后相關，尤其是影響預后的獨立危險因素的DNMT3B、DPP4、CENPE和H3C10基因可能成為兒童AML的分子機制研究以及預后判斷的新靶點。