miR-409-3p通過靶向CACNB2調控糖尿病視網膜病變作用機制研究*

羅 寧,王玲玲

南京市浦口區中醫院:1.內分泌科;2.眼科,江蘇南京 211800

糖尿病視網膜病變(DR)是最常見的糖尿病微血管并發癥之一,主要表現為血-視網膜屏障遭到破壞,發生新生血管的病理學變化,使糖尿病患者視力受損。DR病因學十分復雜,新血管生成主要與人視網膜血管內皮細胞(HRCEC)增殖有關[1]。在DR患者中發現,HRCEC細胞存在遷移與凋亡的情況[2],因此以高糖誘導HRCEC細胞為研究對象,對探索DR的病理過程及發病機制具有重要的意義。微小RNA(miRNA)是長約為22個核苷酸的短鏈非編碼小RNA分子,在轉錄后可抑制機體靶基因的表達而調控信號通路的活性,進一步參與疾病進程[3]。miR-409-3p是近幾年來發現的一種新miRNA,可調控多種腫瘤的發展[4-5],同時有研究表明,miR-409-3p在調節人體微小血管生成中具有重要作用,在血管生成相關的人腦微血管內皮細胞(hCMEC/D3)中下調[6],但是關于其在DR中的功能及作用機制研究甚少。L-型電壓依賴型鈣通道β(CACNB2)是1型糖尿病中DR的一種新的易感基因,有研究表明其在DR患者視網膜細胞中大量表達,并可以調節血管內皮生長因子(VEGF)的分泌[7]。但是,miR-409-3p是否可靶向結合CACNB2,調控DR至今尚罕見相關研究報道。本研究擬觀察miR-409-3p是否靶向調控CACNB2表達影響HRCEC細胞的凋亡、炎癥反應、氧化應激,以期為DR的治療提供可能的新靶點。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材 人HRCEC購自上海中科院細胞庫,胎牛血清(FBS)和DMEM培養基購自美國Gibco公司,四甲基噻唑藍(MTT)試劑盒和胰蛋白酶購自美國Sigma公司,Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司,PCR引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成,逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,RIPA蛋白裂解液、人白細胞介素(IL)-6、IL-18、IL-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自碧云天生物技術公司,BCA蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司,miR-409-3p、miR-con、CACNB2過表達質粒、空白質粒購自北京百奧萊博科技有限公司,雙熒光素酶活性檢測(LRA)試劑盒購自美國Promega公司,CACNB2、活性氧(ROS)、Cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自美國Sigma公司。

1.2HRCEC細胞培養 復蘇HRCEC細胞,用含10% FBS的DMEM培養基置于恒溫培養箱中進行培養,設置條件為37 ℃、CO2體積分數5%、濕度97%。根據細胞生長狀況(細胞融合至80%～90%時傳代),每2～3天傳代1次,傳代時加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞,棄除PBS后,加入0.25%胰蛋白酶溶液消化。

1.3細胞轉染與分組 轉染前一天將1×105個HRCEC細胞接種至6孔板,用50 μL Opti-MEM培養基稀釋miR-409-3p過表達質粒及空白質粒(miR-NC)。將對數期的HRCEC細胞分為對照組、高滲葡萄糖(HG)組、HG+miR-con組、HG+miR-409-3p組、HG+si-con組、HG+si-CACNB2組、HG+miR-409-3p+pcDNA和HG+miR-409-3p+pcDNA- CACNB2組。對照組用5 mmol/L的葡萄糖處理HRCEC細胞48 h,HG組用30 mmol/L的葡萄糖處理HRCEC細胞48 h。按照LipofectamineTM2000試劑盒操作步驟的要求,將相應質粒轉染至HRCEC細胞,轉染持續5 h。轉染成功后,用30 mmol/L的葡萄糖處理繼續培養48 h,收集各組細胞備用。

1.4熒光定量PCR(qPCR)法檢測細胞中miR-409-3p、CACNB2的表達 Trizol試劑提取細胞總RNA,微量核酸儀(美國Thermo公司)對RNA進行定量,按逆轉錄試劑盒操作說明,將RNA逆轉錄為cDNA,對靶基因進行擴增。擴增條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環35次。miR-409-3p:上游引物為5′-GCGAATGTTGCTCGGTGA-3′,下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內參U6:上游引物為5′-ATTCCCCTGTAGGGCTATGA-3′,下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;CACNB2:上游引物為5′-AGGGTCGCTGTTCCTGCATC-3′,下游引物為5′-AATTCTTTGCCTGCTTTTCTG-3′;內參GAPDH:上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2-ΔΔCt法計算miR-409-3p和CACNB2 mRNA的相對表達量。

1.5Western blotting(WB)法檢測蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白,13 400×g離心20 min,收集上清,BCA蛋白試劑盒檢測蛋白樣品濃度。定量蛋白后進行變性,再進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后,轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用5%脫脂牛奶對PVDF膜封閉1 h。然后,分別將CACNB2、裂解的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)和Bcl-2關聯X蛋白(Bax)一抗與 PVDF 膜4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,用辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h,洗膜后顯影,采用凝膠成像系統曝光拍照。使用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內參GAPDH條帶的灰度值的比值進行蛋白相對定量。

1.6LRA驗證靶向關系 TargetScan生物信息學軟件預測顯示,CACNB2的3′端非翻譯區(3′UTR)中含有與miR-409-3p互補的核苷酸序列,即miR-409-3p與靶基因CACNB2存在結合位點。構建CACNB2野生型(CACNB2-WT組)和突變型(CACNB2-MUT組)熒光素酶報告載體。使用LipofectamineTM2000試劑盒分別將CACNB2-WT、CACNB2-MUT與miR-409-3p、anti-miR-409-3p、miR-con、anti-miR-con共轉染至HRCEC細胞。轉染24 h后,通過熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶的活性,結果以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值表示。

1.7活性氧(ROS)熒光強度檢測 采用免疫熒光法檢測ROS熒光強度。以4%多聚甲醛固定細胞15 min,0.5% Triton X-100[以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制]室溫通透10 min,1% BSA室溫封閉30 min,細胞滴加適量稀釋至適當比例(1∶2 000)的ROS一抗,4 ℃孵育過夜,滴加熒光二抗(1∶1 000)。DAPI染細胞核,濃度和時間根據試劑說明書使用,用抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8炎癥因子檢測 收集各組細胞,13 400×g離心20 min,收集上清,參照酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒說明書檢測白細胞介素(IL)-6、IL-18及IL-1β分泌情況,使用全波長酶標儀測得IL-6、IL-18及IL-1β在450 nm波長下的吸光度值,并計算炎癥因子水平。

1.9氧化應激因子檢測 收集細胞,13 400×g離心20 min后收集上清,按照試劑盒操作說明檢測乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)活性,使用全波長酶標儀測得LDH、MDA、GSH在490 nm波長下的吸光度值,嚴格按照試劑盒說明書操作并計算酶活性。

1.10流式細胞術實驗檢測細胞凋亡 收集各實驗組細胞,加入600 μL的結合緩沖液重懸細胞,再按照細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI)操作說明,先加入5 μL的Annexin V-FITC避光反應20 min,再加入5 μL的PI避光反應20 min,300目細胞過濾器過濾后,于1 h內上流式細胞儀完成檢測。凋亡率計算方法如下:細胞的凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

2 結 果

2.1miR-409-3p和CACNB2在人視網膜血管內皮細胞中的表達 與對照組比較,HG組miR-409-3p相對表達量降低(P<0.05),CACNB2 mRNA和蛋白表達量升高(P<0.05)。見圖1和表1。

表1 兩組miR-409-3p和CACNB2 mRNA、蛋白表達量比較

圖1 人視網膜血管內皮細胞CACNB2蛋白表達

2.2miR-409-3p靶向CACNB2表達 miRDB數據庫預測miR-409-3p與CACNB2結合位點見圖2A。LRA檢測結果顯示,相較于miR-con組,轉染miR-409-3p mimics的CACNB2-WT組細胞熒光素酶活性降低(P<0.01);與anti-miR-con組相比,轉染anti-miR-409-3p的CACNB2-WT組細胞熒光素酶活性升高(P<0.01),CACNB2-MUT組細胞熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。miR-409-3p組CACNB2蛋白表達量低于miR-con組(P<0.01),anti-miR-409-3p組CACNB2蛋白表達量高于anti-miR-con組(P<0.01),說明CACNB2為miR-409-3p的靶基因。見圖2B、表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗結果

注:A為預測的miR-409-3p與CACNB2結合位點;B為WB法檢測CACNB2蛋白表達。圖2 miR-409-3p 與CACNB2靶向序列和調控CACNB2蛋白表達

2.3miR-409-3p和CACNB2蛋白表達對HG誘導的HRCEC細胞氧化應激的影響 各組CACNB2蛋白表達量和各組ROS比較,HG組高于對照組,HG+miR-409-3p組低于HG+miR-con組,HG+si-CACNB2組低于HG+si-con組,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組高于HG+miR-409-3p+pcDNA組,差異均有統計學意義(P<0.01)。各組CACNB2蛋白表達量和各組ROS的比較結果一致。與對照組相比,HG組miR-409-3p相對表達量和LDH及GSH水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組miR-409-3p相對表達量、LDH及GSH水平上調,MDA水平下降(P<0.01);HG+si-con組相比,HG+si-CACNB2組miR-409-3p相對表達量、LDH及GSH水平升高(P<0.01),MDA水平下降(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組相比,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組miR-409-3p相對表達量、LDH及GSH水平下降,MDA水平升高(P<0.01)。見圖3、表3。

表3 過表達miR-409-3p、干擾CACNB2對HRCEC細胞LDH、GSH和MDA水平的影響

注:A為WB法檢測HRCEC細胞CACNB2蛋白表達;B為免疫熒光法檢測HRCEC細胞ROS水平。圖3 過表達miR-409-3p、干擾CACNB2對HRCEC細胞CACNB2蛋白和ROS水平的影響

2.4過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HG誘導HRCEC細胞凋亡的影響 與對照組相比,HG組HRCEC細胞Cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.01),Bax蛋白表達量及細胞凋亡率升高(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組HRCEC細胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達量及細胞凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達量及細胞凋亡率升高(P<0.01);與HG+si-con組相比,HG+si-CACNB2組HRCEC細胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達量及細胞凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2水平上升(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組相比,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組HRCEC細胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達量及細胞凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達量下降(P<0.01),見圖4、表4。

表4 過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HRCEC細胞凋亡率及Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

注:A為WB法檢測HRCEC細胞Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達;B為流式細胞術檢測HRCEC細胞凋亡。圖4 過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HG誘導HRCEC細胞的影響

2.5過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HG誘導HRCEC細胞炎癥因子分泌情況的影響 HG組IL-6、IL-18及IL-1β高于對照組(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組IL-6、IL-18及IL-1β下降(P<0.01);HG+si-CACNB2組IL-6、IL-18及IL-1β水平低于HG+si-con組(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組比較,HG+miR-409-3p+ pcDNA-CACNB2組IL-6、IL-18及IL-1β水平升高(P<0.01)。見表5。

表5 過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HRCEC細胞IL-6、IL-18和IL-1β分泌水平的影響

2.6過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HG誘導HRCEC細胞VEGF和ICAM的影響 HG組、HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組VEGF、ICAM蛋白表達量分別高于對照組和HG+miR-409-3p+pcDNA組,HG+miR-409-3p組、HG+si-CACNB2組的RGF、ICAM蛋白表達量分別低于HG+miR-con組、HG+si-con組,差異均有統計學意義(P<0.01)。結果見圖5、表6。

表6 過表達miR-409-3p表達和干擾CACNB2對HRCEC 細胞VEGF和ICAM蛋白表達的影響

圖5 WB法檢測HRCEC細胞VEGF和ICAM蛋白表達

3 討 論

HRCEC細胞的增殖是眼部新血管生成的主要原因,同時會導致機體氧化-抗氧化系統紊亂,分泌過量ROS,破壞細胞結構和功能,引起機體的致炎指標的過度表達,造成機體內環境紊亂[8-9]。因此,抑制HRCEC細胞的增殖及致炎因子分泌、平衡氧化應激系統對抑制DR進程具有積極作用。miRNA參與人類多種疾病的進程中,其中包括糖尿病[10],由于機體miRNA的調控機制復雜,因此關于其調控疾病的機制逐漸成為研究熱點。本研究通過培養暴露于高糖環境的HRCEC細胞,模擬糖尿病患者體內高血糖狀態,分析HRCEC細胞miR-409-3p、CACNB2表達情況,并研究miR-409-3p通過靶向結合CACNB2對HRCEC細胞的氧化應激、凋亡、炎癥的調節作用及相關機制。

有研究發現,miR-409-3p具有調節抗血管生成作用[11],血漿miR-409-3p水平在1型糖尿病發展的過程中逐漸降低,經過治療后隨著病情緩解而有所提高,靶點預測工具將miR-409-3p與免疫和代謝相關信號聯系起來[12]。CACNB2基因與夜盲癥有關并且可改變小鼠的視網膜形態[13-14],其可能通過鈣通道參與DR的發病。本研究發現,miR-409-3p能夠通過負向調節CACNB2抑制新血管生成;同時發現過表達的miR-409-3p或敲減CACNB2均提高了LDH及GSH水平,并使ROS及MDA水平下調,證明了miR-409-3p可以平衡機體氧化應激水平。另外,本研究結果發現,過表達的miR-409-3p抑制了高糖誘導的HRCEC細胞炎癥因子IL-6、IL-18及IL-1β的分泌,降低了HRCEC細胞的炎癥反應,抑制了DR的進程。而miR-409-3p的這種作用能夠被過表達CACNB2明顯減弱。這提示,miR-409-3p參與調節抗血管生成作用可能與其靶向結合CACNB2調控細胞氧化應激及炎癥反應相關。

研究顯示,視網膜色素上皮中VEGF的表達和釋放與CACNB2有關,并通過基因敲除實驗證明了這一論點[15]。有研究發現,VEGF是血管生成和糖尿病視網膜新生血管的形成中起至關重要的作用的能量底物[16],抑制VEGF可防止眼部新生血管形成。在DR患者血清ICAM水平呈高表達,提示其與微血管損傷密切相關[17]。本研究結果證明,過表達miR-409-3p降低了HG環境下HRCEC細胞中VEGF、ICAM蛋白表達量。本研究雖然探討了miR-409-3p通過靶向CACNB2調控DR作用機制,但不足之處在于未研究miR-409-3p在不同嚴重程度DR中的作用,下一步研究重點在于miR-409-3p對DR病情進展的影響。

綜上所述,miR-409-3p可促進HG誘導的HRCEC細胞凋亡,其作用機制與調控CACNB2有關,可為DR的治療提供新靶點。