柚皮素通過抑制Sirt1/AMPKα信號通路減輕乙醇誘導的小鼠肝臟脂肪變性*

王 瑋 陳 熙 楊淑媚 羅 丹 段雪輝 李啟祥

江門市中心醫院消化內科 (廣東 江門, 529030)

酒精性肝病(ALD)是全球常見的慢性肝病之一[1]。酒精性肝損傷的發病機制以肝臟脂肪變性為特征,可發展為肝硬化和肝癌[2,3]。盡管在研究ALD的機制方面取得了重大進展,但目前尚無ALD的推薦治療方法。因此,尋找有效的ALD治療藥物極為重要。柚皮素(NAR)是柚子和其他柑橘類水果中的一種豐富的苷元黃酮,具有降血脂[4]和降血糖[5,6]的特性,多項研究表明NAR可以抑制脂肪生成[7]。研究使用3T3-L1細胞作為脂肪生成系統,證明了NAR以劑量依賴性方式特異性抑制脂質積累和脂肪細胞特異性標記蛋白的誘導[8]。然而,NAR在改善酒精性肝臟脂肪合成代謝功能中的作用和機制尚未明確。本研究旨在研究NAR對酒精性肝臟脂肪變性小鼠脂肪合成和代謝等相關指標的調控作用,并基于沉默信息調節因子1(Sirt1)/腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)信號通路探討NAR調控乙醇誘導小鼠肝臟脂肪變性的機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材 50只雄性成年KM小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002]。乙醇購于美國默克Supelco公司。NAR和白藜蘆醇(RES)均購于購于美國Sigma aldrich公司。蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒與油紅O染色試劑盒購于上海碧云天公司。Trizol試劑盒與Lipofectamine 3 000試劑均購于美國Invitrogen公司。RIPA緩沖液購于美國Pierce公司;PrimeScript RT Regent Kit和SYBR Premix Ex Taq購于日本Takara公司。辣根過氧化物酶偶聯的抗兔 IgG購于美國Jackson Immuno Research公司;SuperSignal試劑購于美國Pierce公司;兔抗Sirt1、AMPKα、p-AMPKα和GAPDH的一抗購于美國Abcam公司。分光光度計酶標儀購于美國Bio-Rad公司;DAB試劑盒購于北京ZSGB-BIO公司。改良的Eagle培養基(D-MEM)和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司。人肝細胞癌細胞系HepG2購于中科院細胞庫(ATCC)。

1.2 酒精性肝臟脂肪變性模型建立及實驗分組 50只雄性成年KM小鼠按隨機數字表法分為Control組、乙醇誘導組(EtOH組)、EtOH+vehicle組、NAR治療組(EtOH+NAR組)、NAR聯合白藜蘆醇(RES)組(EtOH+NAR+RES組),每組10只。EtOH組小鼠正常飼養1周后,自由飲用乙醇飲料(含15%蔗糖),乙醇濃度梯度設置為6%、12%、18%、24%、30%、36%、42%,初始乙醇濃度為6%,每周增加一個梯度直至42%持續至第12周, EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠在EtOH組基礎上于1～12周每周分別靜脈注射0.5 ml生理鹽水、0.5 ml NAR(50 mg/kg)、0.5 ml NAR(50 mg/kg)與RES(45 mg/kg)混合物,每周注射1次。

1.3 HE染色 Control組、EtOH組、EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠處理結束后24 h腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)處死。用含10%福爾馬林的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定肝臟組織。將固定好的標本脫水,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,二甲苯脫蠟,經過乙醇(100%、95%、70%和50%)分餾后再水化。清洗后切片按試劑盒提供的說明書進行HE染色。乙醇脫水分化后,用BX50光學顯微鏡進行觀察。每個切片取自5個不同區域(200倍放大)進行拍照。

1.4 Western Blot 收集Control組、EtOH組、EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠的肝臟組織,用冷PBS 洗滌兩次,在冰上用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液進行裂解。將細胞裂解液在4℃下以15 000 g離心15 min以去除細胞碎片。上清液在含有2% SDS和1%,2-巰基乙醇的上樣緩沖液中,在 95℃加熱5 min。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白裂解物,并使用濕轉移裝置轉移至PVDF膜。膜在室溫下用5%牛奶封閉1 h,然后與兔抗Sirt1(1∶600)、AMPKα(1∶800)、p-AMPKα(1∶500)和GAPDH的(1∶2 000)在4℃下過夜,然后是辣根過氧化物酶偶聯的抗兔IgG孵育4 h。電化學發光系統用于顯示蛋白條帶,ImageJ -lab 3.0版用于分析條帶強度。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 脂肪合成標志物SREBP1、FASN、ACC、SCD1和脂肪酸β氧化標志物PPARα、CPT1α、UCP2的mRNA表達,即Sirt1和AMPK的mRNA表達使用qRT-PCR進行檢測。根據制造商的說明進行操作,通過Trizol試劑收集肝臟組織的總RNA。通過 PrimeScript RT Regent Kit從1 mg RNA中反轉錄得到cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7 500實時PCR系統上進行qPCR。選擇GAPDH作為內參基因,采用2-△△Ct法計算其相對表達量。引物如下(5′-3′):SREBP1-FCCTTGGA-TACAAACTCTGCCCTTT;SREBP1RCGCTTTGGTGTTGTAATCA-CA;FASN-FTTCCTCCGTCTCCACTTA;FASN-RGCGAAGCCTT-GCCATACA;ACCFATC-ATGGCCGAGTGGATAGT;ACCRGCC-ATTCAACTCCTTGCTTT;SCD1-FAGCCAACGTGCAGCCT-TTGT;SCD1-RTC-GCCTGGCTCTCTCCACT;PPARα-FTCACCACGTTC-CAGCGTCTAG;PPARα-RAGCTCTTCCAGTATCGCCTCC。CPT1α-FAG-GCACAAARGAARGCCATAC;CPT1α-RATTGACTGA-GGGAAGGGT。UCP2-FAGACCGTCCAAGTCCGAGAAC;UCP2-RCAGGTTACGACGCC-GFAAGTGGA。2-△△CT的計算公式如下:△Ct= Ct目的基因-Ct內參,記為△Ct對照,用各組的△Ct分別減去△Ct對照平均,求得△△Ct值,再計算各組2-△△CT值,即為各組中基因的相對表達量。

1.6 細胞培養與處理 用D-MEM培養基培養HepG2,培養基補充10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素,HepG2在37℃含有5% CO2的濕潤培養箱中培養。使用生理鹽水(NC)、2.5 mg/L NAR、2.5 mg/L的NAR與2.0 mg/L RES混合物分別處理HepG2細胞,分組為NC組,NAR組,NAR+RES組。通過qRT-PCR觀察細胞中脂肪合成與代謝相關標志物的變化。

1.7 透射電鏡 采用透射電子顯微鏡觀察小鼠肝臟細胞超微結構和細胞脂肪滴形成。將肝組織用2.5%戊二醛4℃固定2 h,1%四氧化鋨4℃固定1 h,脫水,環氧樹脂包埋。組織切片采用超切片機(RMC/MTX;Elexience)。將超薄切片(60～80 nm)安裝在銅網上,與8%的醋酸鈾酰和檸檬酸鉛對比,使用Philips CM100透射電子顯微鏡和TENGRA 2.3 K×2.3 K TEM相機進行觀察,成像后進行分析。

2 結果

2.1 4組小鼠肝臟脂肪變性情況 從HE染色結果可看出,與Control組相比,EtOH組小鼠肝臟組織脂質沉積顯著增加(脂質沉積的HE染色呈非常明顯的空泡狀)。NAR治療后,與EtOH+vehicle組比,EtOH+NAR組的肝臟組織脂質沉積明顯減少。見圖1。

圖1 4組小鼠肝臟脂肪變性圖 (HE染色,200×)

2.2 4組小鼠肝臟中Sirt1/AMPKα信號通路表達 與Control組相比,EtOH組小鼠的Sirt1和AMPK mRNA水平明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05),且Sirt1和p-AMPKα(Thr172)/AMPKα的蛋白表達水平顯著增高,差異有統計學意義(P<0.05)。與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR組、EtOH組小鼠Sirt1和AMPK mRNA水平明顯下調,差異有統計學意義(P<0.05),且Sirt1和p-AMPKα(Thr172)/AMPKα蛋白表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組小鼠肝臟Sirt1/AMPKα信號通路蛋白表達圖 A:qRT-PCR檢測Sirt1和AMPK的mRNA水平;B:Western Blot檢測Sirt1和AMPKα的蛋白水平和定量分析。與Control比,*P<0.05;與EtOH+vehicle比,#P<0.05

2.3 3組小鼠肝臟脂肪變性情況 使用Sirt1/AMPKα信號的激活劑RES與NAR聯合處理EtOH組小鼠,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟組織脂質沉積變化不明顯(空泡狀細胞),而與EtOH+NAR組比,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟組織脂質沉積明顯增加。見圖3。

圖3 3組小鼠肝臟脂肪變性圖 (HE染色,200×)

2.4 5組小鼠肝臟脂肪代謝相關基因的表達情況 與Control組比較,EtOH組小鼠肝臟脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達均顯著增高,而脂肪酸的β-氧化相關基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達均顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05)。NAR治療后,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達均顯著減少,PPARα、CPT1α、UCP2的表達均顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。RES與NAR聯合處理EtOH組小鼠,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1、PPARα、CPT1α、UCP2的表達差異不明顯(P>0.05)。與EtOH+NAR組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達增高,PPARα、CPT1α、UCP2的表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 5組小鼠脂肪合成代謝基因表達圖

2.5 柚皮素通過抑制Sirt1/AMPKα信號通路減少HepG2細胞的脂質變性 采用HepG2細胞系進一步在體外驗證實驗結果。用Sirt1/AMPKα信號通路激活劑RES(0.5 μmol/L)處理HepG2細胞24 h。透射電鏡顯示,與NC組比較,RES組細胞脂質積累顯著增加(P<0.05),SREBP1、FASN、ACC、SCD1表達增高,PPARα、CPT1α、UCP2表達降低(P<0.05)。與RES組比較,NAR+RES組細胞脂質積累顯著降低(P<0.05),SREBP1、FASN、ACC、SCD1表達減少,PPARα、CPT1α、UCP2表達增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 3組HepG2細胞脂肪合成圖

3 討論

本研究結果表明,NAR通過抑制Sirt1/AMPKα信號通路激活,明顯改善酒精性肝臟脂肪變性,提示NAR可能是有效治療ALD的潛在藥物。以往研究表明NAR可影響脂肪生成及前脂肪細胞的早期增殖[6,9,10]。然而,NAR對酒精性肝臟脂肪變性的作用尚未明確。本研究觀察到乙醇誘導肝臟脂肪變性小鼠的肝臟組織中脂質沉積顯著增加,使用NAR治療后小鼠肝臟組織脂質沉積明顯減少。為分析NAR對脂質沉積的影響,通過電鏡觀察HepG2細胞中脂肪合成變化,NAR對脂肪合成的作用與體內實驗一致。以往研究監測到在誘導脂肪生成后的不同時間點添加NAR均可以抑制脂肪細胞發育,能夠明顯減弱脂肪生成;NAR還可以抑制完全分化的脂肪細胞對胰島素敏感的葡萄糖攝取[6,11]。這表明NAR可能對肝臟組織脂肪代謝具有改善作用。本研究提供了NAR調節肝臟臟組織中脂肪代謝的新依據。

本研究還發現NAR可以抑制肝臟脂肪變性小鼠的Sirt1/AMPKα信號通路。據報道,Sirt1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙酰酶[12],可以直接使脂質代謝的關鍵調控因子固醇調節元件結合蛋白1(SREBP1)去乙酰化[13,14],研究表明,在FK866處理的高脂肪飲食小鼠中Sirt1的表達減少[15]。本研究發現酒精性肝臟脂肪變性小鼠Sirt1表達明顯增加,而NAR治療后Sirt1表達明顯減少。AMPK是細胞能量穩態的主要調節因子[16]。Sirt1通過調節肝細胞和動物模型中AMPK的主要上游激酶Lkb1來調節AMPK活性[17],反之,AMPK通過增加細胞NAD+水平來增強Sirt1活性[18]。本研究提供了體內實驗證據,表明NAR顯著降低了酒精性脂肪變性小鼠肝臟中AMPKα的磷酸化(Thr172)水平。而且,脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達都明顯降低,脂肪酸的β-氧化相關基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達都明顯增加。表明NAR具有抑制Sirt1/AMPKα信號通路的作用,從而在抑制肝臟脂肪合成促進脂肪代謝中發揮重要作用。使用Sirt1/AMPKα信號的激活劑RES可以明顯抑制NAR的作用,首先是肝臟組織脂質沉積明顯增加,其次脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達都明顯增高,而脂肪酸的β-氧化相關基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達都明顯減少。采用HepG2細胞系進一步在體外實驗驗證結果,結果表明NAR可以明顯抑制HepG2細胞中的脂質積累,而且脂肪形成基因的表達減少,脂肪酸的β-氧化相關基因的表達都明顯增加。

綜上所述,本研究證明NAR通過Sirt1/AMPKα信號通路介導的脂肪合成和代謝調節功能來抑制酒精性肝臟脂肪變性的假設。EtOH激活Sirt1/AMPKα信號通路,并損害了肝臟脂肪代謝的正常進行,導致小鼠肝臟脂肪變性。柚皮素能夠改善肝臟中的脂質變性,可以作為潛在的治療酒精性肝臟疾病的藥物。本研究已經明確肝臟脂肪代謝受損可能與Sirt1/AMPKα信號通路激活密切相關。因此,靶向Sirt1/AMPKα信號通路的激活可能是預防和治療ALD的新途徑。