消黃去疸湯對ANIT誘導的膽汁淤積性肝損傷大鼠的保護作用*

譚張奎 陳利鋒 盧綺萍

1.中部戰區總醫院風濕免疫科 (湖北 武漢, 430070) 2.中部戰區總醫院普外科

膽汁淤積是由于膽管梗阻或膽汁的分泌-排泄過程受阻而引起的膽汁流動受損,膽汁不循常道流入血液的病理狀態,臨床可表現為全身或面色及小便發黃、乏力、瘙癢等[1]。膽汁淤積性肝損傷(CLI)由肝內膽汁酸代謝異常以及膽汁酸蓄積,導致的肝細胞和膽管細胞受損或死亡。臨床中膽汁淤積患者可進一步發展為肝纖維化,嚴重者可發生肝衰竭[2]。CLI與中性粒細胞介導的炎癥反應及其誘導的氧化應激有關[3]。目前對膽汁淤積引發損害的病因及機制知之甚少,極大地限制了新藥治療物的發現。目前治療膽汁淤積的藥物以熊去氧膽酸(UDCA)和S-腺苷蛋氨酸(SAMe)為主,而這兩種藥物副作用明顯,部分患者對藥物不敏感[4],臨床治療效果受限,因此尋求新的治療藥物迫在眉睫。祖國醫學古籍中無膽汁淤積的病名,根據其癥狀表現可歸屬于“黃疸”范疇,消黃去疸湯來源于《石室秘錄》,主治“黃疸,一身盡黃,面目亦黃者”。現代臨床研究發現其治療急性黃疸療效顯著[5],但缺乏進一步研究。本文旨在探索經典方劑消黃去疸湯的功效,進一步明確其應用范圍,為臨床提供依據,豐富中醫藥治療肝膽疾病的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 28只8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重150～200 g,由遼寧長生生物技術有限公司提供[許可證號:SCXK(遼)2022-0001]。飼養于溫度20～25℃、濕度50%～70%環境,動物自由攝食飲水。本研究經過武漢華聯科生物技術有限公司動物倫理委員會批準(HLK-20230415-001)。

1.2 藥物及制備 消黃去疸湯由茵陳,薏苡仁、茯苓、車前子、肉桂組成,劑量比例為1∶3∶9∶0.2。以上藥材采購于湖北省中醫院中藥房,藥材混合后用6倍量純凈水浸泡1.5 h,先武火再文火煎煮1 h,去滓存液;重復煎煮1次,合并2次濾液,采用旋轉蒸發器濃縮至終濃度0.66 g/ml(以生藥量計),4℃冰箱保存備用。

1.3 試劑與儀器 α-萘異硫氰酸酯(ANIT)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。熊去氧膽酸(UDCA,國藥準字號H20181059)購自湖北省中醫院西藥房。堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海科艾博生物技術有限公司。總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)、總膽汁酸(TBA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Trizol、dNTP、Taq DNA聚合酶試劑購自賽默飛公司。蘇木精購自美國Sigma公司;伊紅Y購自國藥集團。

FlexStation 3型多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司。JA5003型電子分析天平購自上海舜宇平科學儀器有限公司。Chemray型全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。ICV-450型電熱恒溫培養箱購自日本ASONE公司。Nano-100微量分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司。HW-SY11-K電熱恒溫水浴鍋購自北京市長風儀器儀表有限公司。EDC-810型PCR儀購自東勝創新生物科技有限公司。

1.3 分組、造模及給藥 28只SD大鼠按照隨機數字表法分為對照組(NOM)、模型組(MOD)、熊去氧膽酸組(UDCA)、消黃去疸湯組(XHQD),每組7只。NOM組與MOD組大鼠給予同體積的生理鹽水灌胃,UDCA 組大鼠給予60 mg/kg UDCA灌胃,XHQD 組大鼠給予11.23 g/kg消黃去疸湯灌胃,連續7 d。于給藥第5天時除NOM組外其余各組大鼠給予75 mg/kg ANIT橄欖油溶液灌胃復制CLI模型[6],NOM組大鼠給予相同體積的橄欖油灌胃。

1.4 監測各組膽汁淤積大鼠膽汁體積流量 各組大鼠腹腔注射麻醉,取仰臥位固定于手術臺,劍突下開腹,進行膽總管插管手術留取膽汁。為了確保準確測量,插管5 min后對膽汁收集取樣90 min,每15 min記錄1次。膽汁體積流量=膽汁收集量/流出時間。

1.5 標本采集 標本采集前大鼠禁食不禁水12 h。第7天給藥2 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,打開腹腔,使用負壓管從腹主動脈采血。取出肝臟,稱重后自肝右葉剪取一部分肝組織放入4%多聚甲醛中固定以備HE染色檢查,一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定以備電鏡檢查,剩余部分剪成若干小塊分裝于冷凍管后存于-80℃冰箱。采集的血液樣靜置1 h,3 000 rpm離心30 min,吸取上清液于離心管中,-80℃低溫冰箱保存待檢。

1.6 指標檢測 采用全自助生化儀測定各組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及DBil、TBil、TBA水平。酶聯免疫吸附法檢測大鼠肝組織中SOD、GSH、MDA值。HE染色與透射電鏡觀察肝組織病理學變化。實時定量PCR(qRT-PCR)檢測肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達,引物由華研生物科技有限公司合成,序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠膽汁流量的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠各個時間段膽汁流量均降低,差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA組大鼠15、30、75、90 min時間段膽汁流量升高,差異具有顯著統計學意義(P<0.05,P<0.01),45、60 min膽汁流量隨升高,但差異無統計學意義(P>0.05);XHQD組大鼠各個時間段膽汁流量均升高,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠膽汁流量

2.2 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及肝臟指數的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量增加,肝臟指數升高,差異具有統計學意義(P<0.01);與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量減少,肝臟指數降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量及肝臟指數比較

2.3 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清DBil、TBil、TBA水平升高,差異具有統計學意義(P<0.01);與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠血清DBil、TBil、TBA水平降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平

2.4 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠血清中SOD活性,GSH、MDA水平的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清SOD活性及GSH水平降低、MDA水平升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA與XHQD組大鼠血清SOD活性及GSH水平升高、MDA水平降,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠血清中SOD、GSH、MDA及肝臟指數

2.5 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠肝臟組織病理變化的影響 NOM組大鼠肝臟組織結構正常,肝細胞索狀排列整齊,肝細胞間肝竇明顯,未見明顯組織病理損傷改變。MOD組大鼠肝組織形態脂質樣沉積嚴重,細胞核固縮脂肪樣變性,匯管區周圍有結締組織增生,伴隨少量零散炎性細胞浸潤,匯管區見膽管上皮細胞及纖維細胞增生。UDCA組與XHQD組大鼠肝組織匯管區周圍雖有少量結締組織增生,可見少量炎性細胞浸潤,但病變均有改善。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學改變 (HE染色,上:100×,下:200×)

NOM組大鼠的肝細胞超微結構表現出核膜完整、粗面內質網、線粒體清晰可見,結構正常。MOD組大鼠的肝細胞表現出細胞器排列紊亂,脂滴明顯,線粒體水腫,胞質空泡化、毛細膽管微絨毛減少以及膽汁淤積等現象。UDCA組與XHQD組大鼠肝細胞內各細胞器的依然有損害現象,但線粒體、內質網、胞核超微結構病變較輕。見圖2。

圖2 各組大鼠肝細胞超微結構改變 (透射電鏡,1 700×)

2.6 消黃去疸湯對膽汁淤積大鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。見表6。

表6 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平

3 討論

隨著飲食結構、生活環境以及生存壓力變化,情緒的變化嚴重影響肝膽代謝。中醫理論認為肝主疏泄,情志抑郁引起肝失疏泄,膽汁不能正常排泄,膽汁淤阻、蓄積,過量膽汁酸在肝內積聚,造成肝臟損傷。ANIT可引起肝細胞和膽道上皮細胞的損傷和壞死,破壞膽汁酸穩態,在嚙齒類動物中常用于誘導膽汁淤積,給藥后動物模型的生化和病理變化包括轉氨酶升高、膽汁酸水平紊亂、肝細胞凋亡或壞死等,與臨床肝內膽汁淤積癥狀相似[7]。

廣泛存在于肝細胞中的ALT、AST在肝細胞受損后被釋放到血液中,導致血液中ALT和AST濃度升高。ALT是早期肝損傷的主要指標,AST升高提示肝細胞壞死,反映肝損傷程度。ALP和γ-GT升高常見于肝內外膽管阻塞性疾病,膽汁淤積性肝損傷時出現明顯升高[8]。TBil、DBil、TBA是臨床診斷膽汁淤積的重要指標。本研究結果顯示,MOD組大鼠血清中肝功能相關指標明顯升高,肝臟病理切片觀察到肝細胞萎縮呈嚴重長梭狀形態,肝竇和匯管區見炎性細胞浸潤,匯管區見膽管上皮細胞及纖維細胞增生,膽汁體積流量明顯降低,大鼠出現明顯的膽汁淤積。UDCA組及XHQD組大鼠上述指標與病理表現均得到明顯改善,且XHQD組大鼠改善程度更好,提示消黃去疸湯能夠改善并修復大鼠肝細胞的損傷,促進膽汁代謝及排泄,效果優于UDCA組。

SOD、MDA及GSH是機體氧化應激及自我修復的常用指標。有文獻報道SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示體內存在一定程度的氧化應激損傷[9],與本文研究一致。與MOD組相比較,XHQD組大鼠SOD活性提高, MDA和GSH水平降低,提示消黃去疸湯能夠緩解肝組織細胞氧化應激損傷。肝臟中TNF-α的過度表達可誘導產生氧自由基以及脂質過氧化,從引起肝損傷[10]。TNF-α作為促炎因子,可激活肝星狀細胞,同時可促進IL-1β、IL-6等的表達,放大炎癥反應[11]。因此,在膽汁瘀積性肝損傷的疾病中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥因子發揮重要作用[12]。本研究發現,模型大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平升高,XHQD組相應指標均明顯降低,提示消黃去疸湯能夠改善膽汁淤積肝損傷炎癥反應。

總之,消黃去疸湯通過降低膽汁淤積性肝損傷大鼠的炎癥狀態,改善肝功能水平,調整氧化應激水平,從而起保護作用。本文為消黃去疸湯的臨床應用及基礎研究提供了數據支持,但中藥復方存在多成分、多靶點的特點,其有效成分及具體機制尚不明確,有待進一步研究。