基于“肝藏血”理論運用網絡藥理學探究地五養肝膠囊抗肝硬化血小板減少的活性成分與生物學基礎*

鄭自健 鄭吳殷曉 胡春玲 陳樹和 尤朋濤 俞 燦 李瀚旻 周雅君△

1.湖北中醫藥大學藥學院 (湖北 武漢, 430065) 2.湖北中醫藥大學附屬湖北省中醫院藥事部 3.湖北中醫藥大學附屬湖北省中醫院肝病科,肝病研究所 4.武漢市中醫院肝病科

肝硬化是我國臨床上常見的慢性進行性肝病,可由多種慢性肝病發展而來。“肝藏血”是人體肝臟的一個主要生理功能,肝臟具有貯藏血液、調節血量、防止出血的功能,故有肝主血海之稱。《溫病條辯·卷六》載“肝主血,肝以血為自養,血足則柔,血虛則強”。肝生血,血足則肝體自充。疏泄與生血,肝氣與肝血,相互為用,動靜有常。肝藏血功能失常亦常見于肝硬化患者[1],血小板減少是肝硬化患者“肝藏血功能”異常表現的常見異常的微觀指標之一[2,3]。慢性肝病患者中血小板減少癥的發生率約為6%,而肝硬化患者中其發生率可達78%[3]。

中醫學認為肝腎同居下焦,肝主藏血而腎主藏精,精血互生,“肝腎同源”。基于“肝腎同治”“補腎生髓成肝”治療法則的指導下研發的地五養肝膠囊地五養肝膠囊是湖北省中醫院研發的一種新型復方中藥制劑,由茵陳、五味子、甘草、熟地、姜黃五味中藥組成[4],具有抗炎保肝、解毒通絡、清熱利濕、補腎養肝以及調控肝再生的功效,其能夠有效的改善患者的肝功能,臨床上主要用于治療多種慢性肝病[5,6]。地五養肝膠囊臨床使用發現其對肝硬化有顯著療效,亦可顯著逆轉肝硬化患者血小板減少[7-9],但其抗肝硬化血小板減少的作用機制尚未闡明。

網絡藥理學是一門基于生物信息學和計算機應用技術的新興學科,其強調從整體的角度出發,通過構建“成分-靶點-通路”網絡,分析藥物和疾病之間的分子關聯性[10]。本文擬通過網路藥理學的方法,構建“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡,旨在系統完整地發掘出從肝論治地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少的活性成分,探究其潛在的作用機制,以期從分子水平探討其從肝論治肝硬化合并血小板減少的藥理學作用機制,為進一步研究和臨床推廣應用提供參考。

1 數據獲取和處理

1.1 地五養肝膠囊中藥成分活性成分的篩選及靶點庫的構建 地五養肝膠囊中的五味藥物分別為茵陳、姜黃、北五味子、熟地黃以及甘草,在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http://www.tcmspw.com/tcmspsearch.php/)檢索上述五味藥物,進行活性成分的篩選。篩選條件參照藥動學吸收、分布、代謝和排泄(ADME)原則,設定藥物口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性指數(DL≥0.18);此外,結合文獻檢索補充地五養肝膠囊藥材中的有效活性成分,并結合文獻將不滿足篩選條件但公認的具有藥效的化學成分進行進一步補充,獲得候選化合物[11,12]。將納入的化合物成分通過TCMSP、PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmm-apper/)進行靶點預測。所有靶點經Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)校正,去除非人類靶點。

1.2 肝硬化血小板減少癥相關性鐵死亡疾病靶點庫的構建以“Liver cirrhosis”“Thrombocytopenia”“Ferroptosis”為關鍵詞,在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/),NCBI基因數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)進行人類基因檢索,合并檢索結果并刪除重復的基因靶點,構建疾病靶點庫。

1.3 地五養肝膠囊的“活性成分-抗肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點庫構建 通過分析工具Venny 2.1.0將地五養肝膠囊活性成分靶點庫與疾病靶點庫取交集,獲得地五養肝膠囊活性成分抗肝硬化和血小板減少癥相關的潛在作用靶點庫,并將自噬、鐵死亡等信號通路的藥物相關靶點納入。

1.4 地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在靶點的蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將潛在作用靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網絡的構建,將生物種類設定為“Homo sapiens”, 其他參數設置不變以獲得 PPI網絡圖,將互作關系文件以.tsv格式保存,之后導入到 Cytoscape v3.7.1軟件中進行可視化分析,設置參數使節點大小和顏色深淺反映度值的大小,邊的粗細、顏色深淺反映edge betweenness的高低,構建PPI網絡圖。使用NetworkAnalyzer工具對得到的PPI網絡進行拓撲分析,參數包括節點介數中心性、節點緊密度和度值等,通過度值排序,將排名前20的靶點作為關鍵靶點,使用GraphPad Prism 7進行數據可視化。

1.5 地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點的京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路和基因本體(GO)功能富集分析 將地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點導入R 4.2.2軟件,安裝并引用clusterProfiler,enrichplot,ggplot2包和物種注釋包org.Hs.eg.db,進行GO的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組分(CC)富集分析和KEGG富集通路分析,并繪制柱狀圖和氣泡圖進行可視化。

1.6 地五養肝膠囊的“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡構建 以地五養肝膠囊中藥組分、活性成分、“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點、富集得到的地五養肝膠囊抗肝硬化的主要信號通路以及各通路與靶蛋白的對應關系為基礎,構建“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡文件,導入至 Cytoscape v3.7.1軟件中繪制“活性成分-靶點-通路”網絡圖,利用Network Analyzer功能進行網絡拓撲學分析,通過參考拓撲學參數對比活性成分在網絡中的重要性,參數包括節點介數中心性、節點緊密度和度值等,分析主要活性成分,更直觀地展示中藥活性成分在治療肝硬化過程中合并血小板減少的多成分-多靶點的作用特點。

2 結果

2.1 地五養肝膠囊活性成分的篩選及靶點庫的構建 經篩選,茵陳獲得14個化合物成分,244個靶點;姜黃獲得7個化合物成分,129個靶點;熟地黃獲得2個化合物成分,30個靶點;北五味子獲得14個化合物成分,120個靶點;甘草獲得93個化合物,295個靶點。經研究者合并刪重后,共得到127個活性成分和402個作用靶點。

2.2 肝硬化-血小板減少癥相關-疾病靶點庫的構建 經檢索,肝硬化得到5 305個靶點,血小板減少癥得到4 848個靶點,并加入篩選出的鐵死亡和自噬相關通路得到712個靶點,取交集得到241個肝硬化-血小板減少癥相關的靶點。

2.3 地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點庫的構建 通過分析工具Venny 2.1.0將地五養肝膠囊活性成分靶點庫與肝硬化-血小板減少癥的疾病靶點庫取交集,獲得地五養肝膠囊活性成分抗肝硬化合并血小板減少癥相關的潛在作用靶點47個,見圖1,納入藥物抗肝硬化合并血小板減少癥相關活性成分120個。

圖1 地五養肝膠囊活性成分抗肝硬化合并血小板減少癥相關的潛在作用靶點韋恩圖

2.4 地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化血小板減少癥相關性鐵死亡”潛在靶點 PPI網絡的構建 使用STRING數據庫將上述獲得的47個地五養肝膠囊抗肝硬化潛在作用靶點構建PPI網絡,見圖2A,導入cytoscape 3.71軟件中進行可視化分析,節點顏色和大小根據度值調整,節點越大,顏色越紅,度值越大;線的粗細,從粗到細表示edge betweenness從大到小,見圖2B,共獲得47個節點,487條邊,平均度值為20.7。利用Network Analyzer功能進行網絡拓撲學分析,顯示TP53、Alb、TNF、IL-6、MYC、EGFR、PTEN、HIF1A、ESR1、STAT3、ANXA5、JUN、HSPA5、AR、ERBB2、SIRT1、CAV1、PTGS2、GSK3B和CASP8等度值較大,提示與其他蛋白作用力較強,見表1。排名前20的關鍵靶點信息導入GraphPad Prism 7進行數據可視化,見圖2C。

表1 地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少癥相關的關鍵靶點信息

圖2 地五養肝方抗肝硬化合并血小板減少癥相關的潛在作用靶點相互作用網絡及核心靶點篩選

2.5 地五養肝膠囊“活性成分-肝硬化合并血小板減少癥”潛在靶點GO功能與KEGG通路富集分析 利用R4.2.2軟件的clusterProfiler軟件包對地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少的潛在靶點進行GO富集分析和KEGG富集通路分析,根據P<0.05,GO富集分析總共富集到2 547條BP,主要涉及細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、凋亡信號通路的調控(regulation of apoptotic signaling pathway)、凋亡信號通路的負調控(negative regulation of apoptotic signaling pathway)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、細胞對氧化應激的反應(cellular response to oxidative stress)、上皮細胞增殖的調節(regulation of epithelial cell proliferation)、細胞對外界刺激的反應(cellular response to external stimulus)等;65項CC相關,主要涉及囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、膜區(membrane region)等;185項MF相關,主要涉及DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、蛋白酶結合(protease binding)、活化轉錄因子結合(activating transcription factor binding)、抗氧化活性(antioxidant activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)等,取前10個最顯著的條目進行BP、CC、MF氣泡圖和柱狀圖的繪制,見圖3A、3B;根據P<0.05,KEGG信號通路富集分析共富集到183條信號通路,主要富集于乙型肝炎(Hepatitis B)、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)、人巨細胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、細胞衰老(Cellular senescence)、丙型肝炎(Hepatitis C)、人T細胞白血病病毒1感染(Human T-cell leukemia virus 1 infection)等信號通路。將富集得到的結果按照富集數目排序,取前20條信號通路進行柱狀圖和氣泡圖的繪制,見圖3C、3D。

圖3 GO功能與KEGG通路富集分析

2.6 地五養肝膠囊的“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡構建以地五養肝膠囊中藥組分、活性成分、“活性成分-肝硬化-血小板減少癥”潛在作用靶點、富集得到的地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少的主要信號通路以及各通路對應的相關靶點為基礎,構建“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡文件,將“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡文件導入Cytoscape 3.7.1軟件進行通路網絡圖的繪制,墨綠色八邊形代表地五養肝膠囊主要中藥組分,淡綠色圓形代表藥物活性成分,黃色正方形代表地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少的潛在作用靶點,橙色六邊形代表肝硬化疾病,藍色三角形代表主要的信號通路,如圖4所示,更直觀地展示中藥活性成分在治療肝硬化合并血小板減少癥過程中的多成分-多靶點-多通路的協同作用。利用Network Analyzer功能進行網絡拓撲學分析,通過參考拓撲學參數對比化合物在網絡中的重要性,分析主要活性成分,其中槲皮素(quercetin)、異甘草苷(isoliquiritin)、甘草次酸(18β-Glycyrrhetic acid)、綠原酸(chlorogenic acid)、五味子乙素(Schisandrin B )、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)、五味子酯乙(Gomisin B)、五味子甲素(Schizandrin A)、芒柄花素(formononetin)等藥物成分與多個作用靶點存在密切聯系,地五養肝膠囊的核心活性成分見表2。

表2 地五養肝膠囊抗肝硬化血小板減少癥相關性鐵死亡作用核心活性成分

圖4 地五養肝方“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡

3 討論

基于“肝藏象肝臟中心說”肝臟是肝藏的主體,肝藏包含肝臟而不限于肝臟。肝藏血的藏象理論基本包括“有血可藏”(有關血液的生成、丟失或消耗)“調節血量”(有關氣血的調節)和“藏循常道”(有關出血凝血機制)三大內容。液生成不足導致“藏血不足”或“無血可藏”除肝臟病證影響消化吸收導致血液生成不足外,肝臟的造血功能更是與肝藏血功能認識高度吻合[13]。以往研究認為肝藏血為肝生血提供物質基礎,肝以生血氣的實質是指肝為合成補充和代謝交換血液營養物質的重要場所之一[14]。現代醫學已證實促進血小板生成的血小板生成素(TPO)主要由肝臟產生[15],中醫臨床對于血小板減少的患者的治療也以“調肝”為首[16]。在肝纖維化到肝硬化疾病進程中,血小板減少的程度與患者肝臟病變程度具有高度相關性[3],因此,本研究擬以肝為本源探究地五養肝膠囊通過抑制肝纖維化促肝再生的同時探討逆轉肝硬化血小板減少的活性成分和生物學基礎。

網絡藥理學注重藥物對疾病作用的整體性,從活性成分、靶點、通路等方面對藥物的治療作用進行系統性的分析,是目前探討中藥復方對疾病治療藥理作用機制的有力工具。本研究分析了地五養肝膠囊對肝硬化合并血小板減少癥的潛在抑制作用活性成分、調節作用靶點和關鍵信號通路。利用網絡藥理學相關工具篩選得到地五養肝膠囊抗肝硬化合并血小板減少癥作用相關的活性核心成分包括槲皮素、異甘草苷、甘草次酸、綠原酸、五味子乙素等。本研究篩選得到地五養肝膠囊抗肝硬化血小板減少潛在關鍵靶點如TP53、IL6、PTEN、HIF1A、STAT3等均在慢性肝病的免疫調控、炎癥反應、細胞遷移、細胞增殖和凋亡、鐵死亡等生理過程中發揮重要作用[17-21],以往對地五養肝膠囊的網絡藥理學研究分析地五養肝膠囊所含的活性成分,其可能通過肝損傷修復、纖維降解途徑等多種作用進而改善肝病患者肝損傷,并未將鐵死亡、自噬等信號通路納入,本研究結合網絡藥理學分析和文獻調研發現其活性成分除作用肝硬化、肝損傷外均可一定程度上影響鐵死亡信號通路,如槲皮素可通過SIRT1/Nrf2/SLC7A11/GPX4途徑抑制鐵死亡[22]、異甘草苷能夠通過調控肝星狀細胞中鐵死亡相關蛋白Cav-1 、GPX4和COX2表達,抑制肝纖維化[23],通過抑制HIF-1α蛋白及mRNA表達阻斷MLE-2細胞的鐵死亡進程[24]、甘草次酸能抑制HMGB1-TLR4信號通路激活并減少ROS產生進而抑制肝硬化病理過程[25,26]、綠原酸能夠可通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路恢復鐵穩態從而抑制鐵死亡、五味子乙素可激活Nrf2/HO-1/GPX4信號通路抑制鐵死亡途徑[27,28]。PPI網絡的構建也顯示TP53可能為地五養肝膠囊逆轉肝硬化血小板減少作用的潛在首要靶點。TP53作為一種抑癌基因,能夠介導細胞信號轉導,調控細胞增殖、分化和凋亡等過程,其亦可通過調節肝細胞脂質合成與分解、氧化磷酸化和ROS水平參與鐵死亡[29]。

由于在肝臟疾病的不同發展階段中均存在鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統失衡和脂質過氧化物積累等鐵死亡特征[30],目前國內外研究認為鐵死亡對于肝臟疾病的發生發展具有重要的調控作用。近期也有研究顯示,鐵死亡與造血微環境密切相關,且可顯著抑制TPO合成[31]。因此,本研究團隊推測地五養肝膠囊可能通過調控肝細胞鐵死亡通路逆轉肝硬化血小板減少作用。

鐵死亡是一種鐵依賴性細胞死亡途徑,在肝臟疾病以及血小板減少癥的發生和發展中發揮重要作用[32,33]。P53對鐵死亡的不同調節作用可能與疾病微環境有關[17],中醫藥干預p53介導的鐵死亡有雙向調節及多通路多靶點的優勢。諸多研究顯示,中藥單體、單味中藥、方劑、中成藥以及艾灸等均對p53介導的細胞鐵死亡具有較好的改善作用[34]。當前,肝病研究領域對鐵死亡的研究仍停留于理論層面,其發生發展的完整機制尚不明確,且中藥調控從肝論治血小板減少癥的研究尚淺,均未深入研究闡明。

本研究利用網絡藥理學,將鐵死亡途徑相關靶點納入肝硬化血小板減少癥疾病靶點庫的構建中,構建地五養肝膠囊“中藥-成分-靶點-通路-疾病”網絡,對該藥多成分、多靶點、多通路間復雜的協同作用網絡進行了闡述,并對肝硬化血小板減少癥相關性鐵死亡關鍵靶點進行梳理。研究發現地五養肝膠囊調控肝硬化血小板減少與鐵死亡途徑的密切相關,后期課題組擬通過體內外實驗研究對其進行驗證,完善基于網絡藥理學對其作用機制的預測,進一步探討地五養肝膠囊逆轉肝硬化血小板減少作用靶點和分子機制,為豐富肝藏血理論、進一步探討從肝論治血小板減少癥提供科學的理論依據。