基于生物信息學分析PNCK在肝癌中的表達及其與預后、免疫浸潤的相關性*

岳明強 孫立華 郜慶祖 王昕紅

河南省新鄉醫學院第一附屬醫院感染科 (河南 新鄉, 453000)

肝細胞癌簡稱肝癌,肝癌死亡率位居全球癌癥死亡第4位,主要風險因素包括慢性乙型病毒性肝炎、慢性丙型病毒性肝炎、黃曲霉毒素、飲酒、代謝異常等[1]。流行病學研究結果顯示[2],2020年全球肝癌死亡例數約為80萬例,中國肝癌發病率約為18.2/(10萬),死亡率約為17.2/(10萬),且肝癌發病數隨年齡增加逐漸上升。發生局部侵襲、轉移的肝癌患者預后更差,死亡率更高[3],因此,早期明確肝癌的發病機制、侵襲轉移及預后標志物顯得尤其重要。妊娠上調的非泛素性鈣調蛋白激酶(PNCK)是鈣調蛋白激酶Ⅰ家族成員之一,近年來發現PNCK屬于一種促癌基因,在多種腫瘤如鼻咽癌[4]、乳腺癌[5]等顯著高表達,且與不良預后有關。然而,目前關于PNCK在肝癌中的表達及相關機制尚不清楚,本研究通過生物信息學方法探討PNCK在肝癌中的表達水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數據庫 TCGA數據庫(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga);GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/);HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org/);TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/);DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp);LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org)?

1.2 研究方法

1.2.1 PNCK mRNA在肝癌組織中的表達及其與預后的關系TCGA數據庫中下載肝癌患者的基因表達數據,其中肝癌組織374例,正常組織50例,還包括50例癌組織及配對的癌旁組織,樣本中PNCK mRNA表達水平采用Log2轉換。肝癌患者預后的危險因素采用Cox回歸分析。

1.2.2 K-M曲線生存分析 利用GEPIA數據庫分析肝癌組織中PNCK mRNA表達水平和患者中位生存時間的關系。

1.2.3 肝癌組織中PNCK蛋白表達水平 利用HPA數據庫分析PNCK蛋白在肝癌組織及正常組織中的表達差異。

1.2.4 免疫浸潤分析 通過TIMER數據庫中的“Immune association”模塊探索PNCK與肝癌組織中免疫細胞浸潤程度的相關性,包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞(Neutrophils細胞)、樹突狀細胞(DC細胞)等。

1.2.5 肝癌組織中PNCK共表達基因 從LinkedOmics數據庫中篩選肝癌組織中與PNCK共表達基因,參數設置P-Spearman<0.01。分別獲取前50個與PNCK顯著正相關和顯著負相關的基因。

1.2.6 GO、KEGG富集分析 采用DAVID數據庫對100個共表達基因進行功能注釋和富集分析,主要包括基因本體論(GO)和KEGG信號通路。GO分析包括細胞組成(CC)、分子功能(MF)和生物學過程(BP)。本研究中選擇富集最為顯著的前5個條目。

1.3 統計學方法 肝癌組織中和正常組織及癌旁組織中PNCK mRNA表達差異的比較采用Wilcoxon檢驗,肝癌患者預后的危險因素采用Cox回歸分析,PNCK mRNA表達水平與肝癌患者中位生存時間的相關性采用K-M曲線分析,免疫浸潤分析采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PNCK mRNA表達水平和肝癌患者預后的相關性分析 單因素結果顯示,T分期、M分期、病理學分期、PNCK mRNA表達水平與肝癌患者預后有關;多因素分析結果顯示,PNCK mRNA表達水平(高表達)是影響肝癌患者預后的危險因素,見表1。K-M曲線結果證實,PNCK mRNA高表達及低表達的肝癌患者生存時間為46.6和84.4個月,與PNCK mRNA低表達相比,PNCK mRNA高表達患者中位生存時間顯著降低(P=0.002),見圖1。

圖1 PNCK mRNA表達水平與肝癌患者預后的K-M曲線

表1 肝癌患者預后的危險因素COX回歸分析

2.2 PNCK mRNA在肝癌組織中的表達水平 肝癌組織374例,正常組織50例,肝癌組織中PNCK mRNA表達水平為0.041(0.010,0.365),正常組織中PNCK mRNA表達水平為0(0,0.015),與正常組織相比,肝癌組織中PNCK mRNA表達水平顯著升高(P<0.001);50例肝癌組織及配對的癌旁組織,肝癌組織中PNCK mRNA表達水平為0.028(0,0.194),正常組織中PNCK mRNA表達水平為0(0,0.015),與正常組織相比,肝癌組織中PNCK mRNA表達水平顯著升高(P<0.001)。見圖2。

圖2 不同組織中PNCK mRNA表達水平

2.3 肝癌組織中PNCK蛋白表達情況 HPA數據庫結果提示,PNCK蛋白在肝癌組織中呈高表達,在正常肝臟組織中呈低表達。PNCK在肝癌中主要表達于細胞質中, 見圖3。

圖3 HPA數據庫中PNCK在正常組織及肝癌組織中的表達(×200 μm)

2.4 肝癌中PNCK與免疫浸潤細胞的相關性 進一步探討肝癌組織中PNCK和免疫浸潤細胞的相關性,結果顯示,肝癌組織中PNCK mRNA表達水平與Th2細胞、TFH細胞、NK CD56bright細胞等呈顯著正相關(P<0.001),與DC細胞、Neutrophils、Th17 細胞等呈顯著負相關(P<0.001)。見圖4和表2。

圖4 肝癌組織中PNCK mRNA表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

表2 肝癌組織中PNCK mRNA表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

2.5 肝癌中PNCK共表達基因及GO、KEGG富集分析 通過數據庫進一步篩選前50個與PNCK顯著正相關和負相關的基因,將100個共表達基因進行GO、KEGG富集分析,結果顯示,肝癌組織中PNCK共表達基因主要富集的BP包括胰島素分泌調節等;主要富集的CC包括線粒體基質等;主要富集的MF包括氧化還原活動等;主要富集的KEGG信號通路包括代謝途徑、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生等。結果見表3。

表3 肝癌組織中PNCK共表達基因的GO、KEGG富集分析

3 討論

肝癌屬于全球最為常見的惡性腫瘤之一,多由于慢性乙型病毒性肝炎發展導致,發病率和死亡率均較高。鑒于肝癌發病機制復雜,篩選出新的肝癌預后標志物對提高肝癌患者的預后和實現個體化靶向生物治療均有著重要意義。PNCK是鈣調蛋白激酶Ⅰ家族成員之一,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,人PNCK基因定位于Xq28,既往認為,PNCK表達可能限于特定的乳腺上皮細胞類型[6],而近年來發現PNCK在多種腫瘤中均呈現高表達現象[4-5,7],Xu等[7]通過體內外實驗發現PNCK在鼻咽癌中顯著高表達,PNCK沉默后通過PI3K-AKT信號通路抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲并促進凋亡。然而,目前PNCK在肝癌中的具表達水平尚不清楚。本研究基于多個數據庫結果證實,PNCK在肝癌組織中顯著高表達,且預后分析也證實PNCK高表達是影響肝癌患者不良預后的獨立危險因素,PNCK高表達的肝癌患者中位生存時間顯著縮短,這結果均提示PNCK可能在一定程度上促進了肝癌的發生發展,PNCK可作為肝癌預后不良的標志物之一,PNCK可作為肝癌個體化靶向治療的一個新靶點。

腫瘤常常伴隨著免疫微環境異常,腫瘤細胞、免疫細胞、細胞因子、細胞外基質等共同構成腫瘤免疫微環境,近年來發現免疫微環境在在肝癌進展、免疫耐受、免疫逃逸和治療抵抗中發揮著重要作用[8-10]。本研究發現肝癌組織中PNCK mRNA表達水平與多種免疫細胞浸潤程度顯著相關,如PNCK mRNA與Th2細胞、巨噬細胞等浸潤程度具有顯著正相關性,Th2細胞作為一種T淋巴細胞亞型,研究顯示Th2細胞相關細胞因子IL-4和IL-6在肝癌患者血清中顯著高表達[11],且相對于無肝癌家族成員而言,Th2細胞相關因子IL-4表達水平在肝癌家族患者中表達水平更高[12],在肝癌經過熱消融治療后,癌組織和血清中Th2相關性細胞因子表達水平顯著下降[13]。巨噬細胞主要起源于骨髓源性單核細胞,M2型巨噬細胞可通過分泌細胞因子和趨化因子刺激腫瘤的發生、發展及轉移[14]。孫文兵等[15]證實肝癌細胞來源外泌體miR-151可誘導巨噬細胞發生M2型轉化從而促進肝癌細胞的遷移及侵襲,此外,抗腫瘤藥物高良姜素可通過調控Wnt/β-catenin通路促進巨噬細胞M2型向M1型轉化,降低Zbed3表達水平并促進肝癌細胞凋亡并減小瘤體體積[16]。

為進一步探討PNCK在肝癌發生發展中的調控機制,我們基于LinkedOmics 數據庫共鑒定出肝癌中與PNCK顯著相關的100個共表達基因,對共表達基因進行GO和KEGG富集分析,結果顯示,這些共表達基因主要富集于丙酮酸代謝、糖酵解等途徑,提示PNCK主要涉及代謝編程途徑等參與肝癌的發生發展。在腫瘤細胞中,有氧糖酵解是腫瘤細胞獲取能量的主要途徑,腫瘤免疫微環境中成熟T細胞會發生代謝重編程,可活化有氧糖酵解途徑,為腫瘤細胞的快速增殖提供能量[17]。郭舜等[18]研究發現,黃芩素可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲,同時顯著降低肝癌細胞的能量代謝水平,作用機制與其能抑制肝癌細胞糖酵解及谷氨酰胺代謝有關,此外,白藜蘆醇同樣可通過調節糖代謝重編程抑制肝癌細胞的增殖[19]。因此,上述結果提示PNCK可能通過調節代謝編程促進肝癌的進展。

綜上所述,PNCK在肝癌中高表達,可能作為肝癌預后不良的標志物之一,PNCK可能通過調控腫瘤免疫微環境及代謝編程等途徑參與了肝癌的發生發展,本研究為肝癌的個體化診療提供了新的靶點,然而,PNCK在肝癌中的功能和作用還需要分子生物學實驗進一步驗證。