解磷生物肥對溫室土壤磷有效性及辣椒產量的影響

吳紅艷， 于淼， 馮健， 劉暉

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

隨著我國設施農業的迅速發展，設施蔬菜種植面積逐年擴大，種植面積超過120 hm2，占我國蔬菜種植面積的18%[1]。由于設施蔬菜種植時地表長期覆蓋栽培，土壤處于高溫高濕、無雨水淋溶狀態，造成了土壤板結、酸化、次生鹽漬化、養分失調、土傳病害加重等一系列問題，影響蔬菜產量和品質，在一定程度上阻礙了設施農業的可持續發展。磷是植物生長所需的重要元素，是植物體內核蛋白質、磷脂、核酸的重要組成部分，直接參與脂肪和蛋白質代謝，能促進植物幼苗生長及根系發育，縮短成熟期，提高結實率和品質。此外，磷還能提高作物抗旱、抗寒、抗倒伏和抗病蟲害能力，促進增產增收。我國土壤雖全磷含量較高，但以可溶性磷鹽形式存在被植物直接吸收利用的磷源僅為2%左右，大部分以難溶的無效態在土壤中積累，這不僅耗竭有限的磷資源、造成環境污染，還會給食物安全和人類健康帶來影響[2]。因此，施用含磷肥料成為增加土壤肥力的重要手段。目前，我國農用磷肥主要由磷礦加工制成化學磷肥，施入土壤后易與土壤中的鈣、鎂、鐵、鋁離子結合，形成難溶的螯合磷酸鹽，大大降低磷的利用率，長期施用會造成土壤板結和環境污染[3-4]。提高土壤中有效磷含量、減少磷肥對環境的污染，是目前亟待解決的難題。

在眾多土壤磷有效性影響因素中，微生物對土壤磷轉化和利用起著重要作用。王應蘭[5]研究發現，細菌肥料以及菌液的施用都會影響土壤吸收利用磷的能力。解磷菌是土壤中能將難溶性磷轉化為植物可吸收利用可溶性磷的微生物類群，主要通過分泌各種酶類、有機酸來活化土壤中的難溶性磷，提高土壤有效磷含量，促進作物的生長發育[6]。作物根際區域是個復雜的生態環境，需要微生物與作物根系共同作用才能完成物質吸收和運輸過程。因此，利用解磷菌的轉化作用制成肥料、有效提高土壤有效磷含量并促進作物吸收利用，是解決上述難題的一種有效途徑。胡英宏等[7]研究表明，微生物菌肥具有增加土壤肥力、增強植物對養分吸收、提高作物抗病能力、減少環境污染等多種功能。另有研究表明，微生物菌劑中含有的功能菌能優化土壤微生物種群結構，增強土壤酶活性，加快土壤有機物質分解并促進固定養分的有效轉化，進而促進植株根系及地上部的生長[8-9]。生物有機肥是一種新型的生物肥料，不僅含有大量的有機質和豐富的微量元素，還含有活躍的微生物菌群和活性酶[10]，所發揮的肥效主要源于微生物生命活動，從而改良土壤[11]、促進植物生長、提高作物品質、增加作物產量[12]。解磷菌的應用對改善土壤結構、提高土壤中磷利用率、改良鹽堿地和維持農林業生態平衡等具有重要意義[13]。現今解磷生物有機肥存在企業發展過快，產品質量參差不齊，產品中成分構成不科學等問題。本研究將從設施辣椒土壤中分離得到的解磷菌P623-9 與有機肥復配，制成新型解磷生物肥（PSWY），以北方溫室廣泛栽培的辣椒為試驗材料，采用室內盆栽試驗方法研究分析新型解磷生物肥（PSWY）、解磷菌P623-9 和雞糞（腐熟）對土壤有效磷（available phosphorous，AP）、微 生 物 量 磷（microbial biomass phosphorus，MBP）含量及辣椒根系、地上部干重和產量的影響，以期為其市場化應用和推廣提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及植物材料 供試菌株為解磷菌，為遼寧省微生物科學研究院自辣椒植株土壤中分離篩選得到的韓國假單胞菌（Pseudomonas koreensis），菌株編號P623-9，具有發明專利權（專利號ZL2019 1 1323360.4），現由廣東省微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號GDMCC NO. 60806。

供試植物材料為辣椒，品種為‘辣椒409’。

1.1.2 培養基 解磷菌液體培養基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Ca3(PO4)22.0 g，1% FeSO4·7H2O 1 mL，1% MnSO4·4H2O 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

解磷菌固體培養基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)22.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷生物有機肥載體篩選 腐殖酸（史丹利農業集團股份有限公司，含有機質62%、氮1.6%、磷0.86%、鉀0.31%）是一類有機物質，具有吸收、絡合、交換等功能及良好生理活性，且環境友好、材料易得。蚯蚓糞（石家莊上禾生物科技有限公司，含有機質49%、氮2.6%、磷2.0%、鉀1.0%）是一種具有很好的孔性、通氣性、排水性的細碎類物質，具有吸收和保持營養物質能力。雞糞（腐熟）（遼寧朝陽五谷豐生物科技有限公司，含有機質51%、氮2.34%、磷2.32%、鉀0.98%）可增加土壤吸附表面積，提高土壤保水、保肥和透氣性能，調節土壤溫度，在生態農業建設、無公害農業生產等方面具有不可忽視的作用[14]。試驗選擇腐殖酸、蚯蚓糞、雞糞（腐熟）作為菌肥載體，從其生物毒性、吸水性及有效菌體釋放量等方面篩選出最適合作為菌肥吸附劑的載體。

①毒性分析。將P623-9 菌液分別接種于3 種含有5 g 滅菌供試載體的50 mL 蒸餾水中，200 r·min-1震蕩2 h，過濾備用。利用梯度稀釋法測定有效菌數量，與原始接種菌落數進行比較，判斷載體對菌種生長是否具有毒性。

②載體吸水性及有效菌體釋放率測定。將3 種供試載體分別粉碎、研磨，過60 目篩，置高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃高壓蒸汽滅菌1 h 后，置于鼓風干燥箱中105 ℃烘干至恒重，冷卻至室溫，分別取10 g供試載體在無菌條件下少量多次將無菌水與其充分混勻，使載體材料濕潤、疏松但不結塊，記錄載體吸水量。

將3 種供試載體滅菌后分別加入與無菌水等量的菌種發酵液，混合均勻后室溫晾48 h后，精確稱取10 g 供試載體，置于100 mL 無菌水中200 r·min-1充分混勻4 h，立即使用梯度稀釋法涂布于平板，根據下列公式計算載體有效菌體釋放率。

1.2.2 解磷生物有機肥（PSWY）的制備 將解磷菌P623-9 發酵液分別與3 種載體復配（其中，PSWY 載體為腐熟雞糞，養分含量為氮2.34%、磷2.32%、鉀0.98%；發酵液與載體的比例均以有效活菌數計，即有效活菌數在0.2×108CFU·mL-1以上），濕度≤30%，置干燥陰涼處保存備用。

1.2.3 不同載體中菌體存活數量測定 采用稀釋平板法，將保存在室溫的解磷生物有機肥（PSWY）分別在第5、10、15、30、45、60 天時測定有效活菌數，同時采用肉眼直接觀察法檢查保存過程中是否有霉變（如青霉、曲霉污染）、是否有異味產生等。

1.2.4 盆栽試驗設計 供試土壤為遼寧省微生物科學研究院試驗基地日光溫室大棚耕層土壤，褐土，pH 7.2，有效磷含量39.8 mg ·kg-1，微生物量磷22.6 mg·kg-1，總氮1.59 g ·kg-1。選用直徑17 cm、高30 cm的塑料花盆，每盆裝風干土5 kg，解磷生物有機肥在辣椒定植時與化肥（常規施肥）一同施入。

試驗設4 個處理，分別為常規施肥（N 100 kg·hm-2、P2O570 kg·hm-2、 K2O 80 kg·hm-2，CK）、常規施肥+雞糞（腐熟）3 000 kg·hm-2（PY1）；常規施肥+PSWY 3 000 kg·hm-2（PY2）；常規施肥+解磷菌P623-9 240 L·hm-2（PY3）。辣椒于9月7日定植，12月7 日收獲。有機肥施用量根據每年所用肥料養分分析結果，以全磷含量為標準折算。本研究中所有處理均將尿素、磷和鉀肥按常規施肥量作為基肥一次性施入，不再追肥，施肥方法為播種前施入定植植株底部2～3 cm 處，各處理均按日光溫室大棚辣椒常規管理方式管理。通過評價辣椒盆栽試驗中土壤解磷菌數量、土壤有效磷、微生物量磷含量、辣椒地上部干重和產量篩選解磷生物有機肥施用量[15]。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 供試樣品采集及處理 土壤樣品在植株不同生長時期進行采集，去除表層土壤及根系，采集各處理表層土壤（0—20 cm），混合均勻，3 個重復，一部分鮮樣用于分析土壤有效活菌數及微生物量磷含量；另一部分樣品陰涼處風干，去雜，過1 mm篩后用于測定土壤有效磷（AP）含量。

1.3.2 土壤解磷菌數量測定 土壤樣品混合均勻，稱取5 g置于45 mL無菌水中30 ℃振蕩30 min，采用平板梯度稀釋法將不同水平的土壤溶液涂布于解磷菌固體培養基平板上，30 ℃培養48 h，觀察菌落生長情況，并計數。

1.3.3 土壤有效磷和微生物量磷含量測定 土壤有效磷（AP）含量采用HCl-H2SO4浸提，利用全自動流動注射分析儀MAC3（iFIA7，北京吉天儀器有限公司）測定[16]；土壤微生物量磷（MBP）含量采用氯仿熏蒸提取法測定[17]。

1.3.4 辣椒地上部干重及根系測定 在辣椒生長90 d 時收獲，貼近地面將地上部分剪下，置于105 ℃殺青30 min 后，80 ℃烘干至恒重，然后稱重[16]；同時小心將根取出，洗凈泥沙，陰干。測量主根直徑、根長，并對根系進行稱重。

1.3.5 辣椒產量測定 辣椒產量為連續采收計產，置于105 ℃殺青30 min 后，80 ℃烘干至恒重，進行稱重[16]，于結束期合并計算。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007 進行數據整理與計算，采用SPSS 25.0 進行單因素方差分析，選用LSD（P<0.05）進行多重比較，進行差異顯著性及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 載體選擇

不同載體毒性分析結果表明，3 種載體中有效菌體存活數量表現為雞糞（腐熟）>腐殖酸>蚯蚓糞，均高于原始接種菌落數，說明3 種載體對于菌體生長均無毒性，因此均具有作為菌肥載體的潛力。載體吸水能力在一定程度上可以反映不同載體對于菌株的吸附能力；而有效菌體釋放率直接影響生物有機肥的使用效果。由表1 可知，蚯蚓糞吸水能力較強，雞糞（腐熟）次之，最弱的為腐殖酸；蚯蚓糞吸水能力雖強，但其菌體釋放率為3 種載體中最低的，僅為59%，雞糞（腐熟）的有效菌體釋放率最高，達85%，腐殖酸次之，為72%。

表1 載體吸水性及有效菌體釋放率Table 1 Carrier hydroscopicity and effective cell release rate

由圖1可以看出，室溫條件下有效活菌數隨著時間變化較大，解磷菌P623-9在腐殖酸、蚯蚓糞和雞糞（腐熟）3 種載體中的存活數量在15 d 內無顯著差異，在30 d 時各處理均達到峰值，分別為1.91×109（lg 9.28）、6.53×108（lg 8.81）和5.95×109（lg 9.77） CFU·g-1，各處理差異顯著（P<0.05）；60 d時在3 種載體中的存活量分別為原始接菌數量的2.10%、0.38%和44.50%，載體為雞糞時與腐殖酸和蚯蚓糞均存在顯著差異（P<0.05）；3 種載體在60 d 監測時間內均無青霉、曲霉等污染，無異味。以上結果表明，最適合以解磷菌P623-9 制備解磷生物有機肥的載體為雞糞（腐熟）。

圖1 不同載體不同時間下的菌體存活數量Fig. 1 Survival number of bacteria in different carriers at different times

2.2 不同施肥處理對土壤解磷菌數量的影響

由圖2 可以看出，整個辣椒生長過程中各處理解磷菌活菌數量均在30 d 時達到峰值，CK、PY1、PY2 和PY3 分別為2.15×104（lg 4.33）、2.39×108（lg 8.38）、1.81×1010（lg 10.26）和8.31×108（lg 8.92） CFU·g-1，之后總體呈下降趨勢，生長至60 d時PY1、PY2解磷菌活菌數量與其他2個處理差異顯著（P<0.05），收獲期降至最低水平，在1.05×103（lg 3.02）～2.17×105（lg 5.34） CFU·g-1，此時PY1 與PY2 相比活菌數差異不顯著。可見，在同一化肥施用量條件下，施肥方案PY2 對土壤中解磷菌數量具有較大影響。

圖2 不同施肥處理下土壤解磷菌數量Fig. 2 Quantity of soil phosphorus solubilizing bacteria in different fertilization treatments

2.3 不同施肥處理對土壤有效磷含量的影響

由圖3 可以看出，在辣椒整個生長過程中各處理土壤有效磷（AP）含量變化趨勢基本相同，均在30 d 時達到峰值，90 d 時降至較低水平。生長期內，CK、PY1、PY2 和PY3 有效磷含量平均值分別為32.33、45.56、65.63 和57.31 mg·kg-1，較CK 分別提高40.9%、73.1%和38.1%，PY2 處理明顯高于其他3 個處理；辣椒生長至30 和60 d 時，PY2 處理土壤AP 含量與其他3 個處理均存在顯著差異（P<0.05），而降至較低值時（90 d）PY2 與其他3 個處理仍呈現顯著差異（P<0.05）。因此，辣椒生長過程中PY2 處理土壤AP 含量均較高，說明適量施用解磷生物有機肥（PSWY）能夠有效提高土壤AP 含量。

圖3 不同施肥處理下土壤有效磷含量Fig. 3 Soil available phosphorus content under different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理對土壤微生物量磷的影響

由圖4 可知，在辣椒生長期內各施肥處理土壤微生物量磷（MBP）整體變化趨勢基本相同，30 d前均呈上升趨勢，在30 d時達到峰值，然后開始降低，至60 d 趨于穩定后緩慢下降，直至生長結束。整個生長期CK、PY1、PY2、PY3 的MBP 平均值分別為18.47、22.79、29.35 和26.86 mg·kg-1，PY1、PY2 和PY3 較CK 分別提高23.4%、58.9%和45.4%。在生長30 d時，PY2處理與其他3個處理土壤MBP 含量均差異顯著（P<0.05），PY1 和PY3處理差異不顯著，但二者與CK 相比均差異顯著（P<0.05）；而生長至60 d時，4個處理之間MBP含量均差異顯著（P<0.05）。因此，解磷生物有機肥（PSWY）可以有效提高土壤MBP 含量。

圖4 不同施肥處理下土壤微生物量磷含量Fig. 4 Soil microbial biomass phosphorus content in different fertilization treatments

2.5 不同施肥處理對辣椒地上部干重及根系的影響

由圖5 可知，在辣椒生長期結束時地上部干重表現為PY2>PY1>PY3>CK，PY1、PY2、PY3 處理較CK 分別增加81.9%、122.2%和66%，且PY2處理與其他3 個處理差異顯著（P<0.05），表明PY2處理對于提高辣椒地上部干重具有顯著促進作用。由表2 可知，PY1、PY2 和PY3 處理的辣椒整根干重較CK 分別增加29.0%、62.0%和4.9%，且PY2 與其他3 個處理差異顯著（P<0.05）；根長度PY1、PY2 和PY3 處理 較CK 分別增加3.2%、19.4%和16.0%，PY2 處理與PY1、CK 差異顯著（P<0.05），與PY3差異不顯著；主根直徑PY1、PY2和PY3 處 理 較CK 分 別 增 加12.3%、26.0% 和9.2%，PY2 與其他3 個處理均差異顯著（P<0.05）。表明PY2 處理即解磷生物有機肥（PSWY）對于辣椒根系生長發育具有良好促進作用。

圖5 不同施肥處理下辣椒地上部干重Fig. 5 Aboveground dry weight of pepper under different fertilization treatments

表2 不同施肥處理下辣椒整根干重、長度及主根直徑Table 2 Whole root dry weight， length and taproot diameter of pepper under different fertilization treatments

2.6 不同施肥處理對辣椒產量的影響

圖6 結果表明，辣椒產量表現為PY2>PY1>PY3>CK，PY1、PY2 和PY3 處理較CK 分別增產10.9%、14.5% 和7.7%，與CK 相比均差異顯著（P<0.05），且PY2 與其他3 個處理均差異顯著（P<0.05），表明解磷生物有機肥（PSWY）對辣椒具有顯著增產效果。

圖6 不同施肥處理下的辣椒產量Fig. 6 Pepper yield under different fertilization treatments

2.7 土壤解磷菌數量、土壤有效磷、微生物量磷和植株地上部干重及產量相關性分析

由表3 可知，在辣椒生長期內土壤有效磷與土壤解磷菌數量、辣椒地上部干重、辣椒產量、壤微生物量磷含量均呈顯著正相關（P<0.01）；辣椒產量與植株地上部干重、土壤解磷菌數量和土壤微生物量磷含量均呈顯著正相關（P<0.01）。可見，在相同施用化肥條件下適量增施解磷生物有機肥時，隨著土壤中解磷菌數量增加微生物量磷及有效磷含量也隨之顯著增加，辣椒地上部干重和產量也相應顯著增加，土壤AP、MBP 含量及其周轉對提高辣椒潛在供磷能力具有重要意義。

表3 土壤有效磷含量、辣椒地上部干重、辣椒產量、土壤解磷菌數量及微生物量磷的相關性分析Table 3 Correlation analysis between number of soil phosphorus solubilizing bacteria， soil MBP， plant dry weight， pepper yield and soil AP

3 討 論

3.1 解磷生物有機肥對土壤微生物量磷和有效磷的促進作用

本研究中，土壤AP和MBP含量均在30 d時達到峰值，這與已有研究結果一致[18]。張博凱等[18]研究發現，施入磷肥能夠很快轉化為微生物量磷,約30 d 時高達87%的32P 轉化為微生物量磷。究其原因,可能與土壤微生物以多聚磷酸鹽富集磷的作用有關，微生物活性越高，富集磷的能力越強，土壤呼吸速率與土壤微生物含磷量變化趨勢一致，微生物量磷是土壤最活躍的磷組分。微生物量磷對土壤環境變化十分敏感，溫度、干濕交替、不同土壤剖面層次、理化性質及管理措施改變均可引起土壤微生物量磷的變化[19]，在PSWY 施入土壤后辣椒生長前期和中期時增加了有效磷的累積量，此時解磷菌能活化根系周圍磷元素，使土壤有效磷含量處于上升水平[20]，使其易被植物吸收，而有很大一部分磷素迅速轉化為微生物量磷，并在30 d 時隨著微生物死亡而緩慢地釋放出來,這在一定程度上減少了磷的物理化學固定,從而提高了磷肥利用效率[21]。另外，本研究中土壤AP含量增加了73.1%，而方華舟等[22]研究顯示，解磷菌劑處理稻田土壤，僅使土壤有效磷含量增加32.17%，說明單獨施用有機肥時雖在一定程度上有利于減少土壤氮素的淋失，但會增加磷素淋失風險[23]，從而造成土壤養分不均衡，影響作物生長發育及產量。

3.2 解磷生物有機肥可增加地上部干重、促進辣椒根系生長發育并提高產量

Gui?azú等[24]從堆肥中分離出2株具有較強解磷能力的菌株,并將其制成菌劑,發現其對苜蓿生長具有良好的促進作用；Hameeda 等[25]通過盆栽及田間試驗研究表明,解磷菌劑能較好地促進玉米生長，這與本研究中解磷生物有機肥能促進辣椒地上部干重增加的結果一致。本研究中，施用解磷生物有機肥辣椒整根干質量、根長和主根直徑均增加，促進了根系的生長發育，這與蔣欣梅等[26]研究結果一致，原因在于生物有機肥應用于作物根區時，能刺激植物吸收營養、提高營養效率。有研究認為生物有機肥促進養分積累主要是通過促進根系生長，提高根系活力來實現的[27]。本研究中，辣椒產量顯著增加，與苑偉偉等[28]和曾洪玉等[29]研究結果相一致。任朝輝等[30]研究認為，適量施用磷肥可以顯著提高作物的產量，過量施用則會導致減產，這與本研究結果一致，當單獨施用菌液時造成磷素過量，土壤有效磷含量降低，辣椒產量減少。磷對農作物產量有重要的影響，適量的磷肥能夠有效促進農作物的正常生長，但磷肥用量過多時會引起植株體內磷素或氮素過度集中，引起磷素積累，從而抑制生物量的累積[31]，進而影響農作物的生長發育。因而適宜的生物累積量及合理的養分累積吸收是促進辣椒生長發育和實現高產的重要因素。

本研究表明，施用解磷生物有機肥（PSWY）后提高了土壤有效磷含量，對辣椒根系及地上部干重均具有良好的促進作用，辣椒產量與對照相比增加14.5%，與其他3 個處理均具有顯著差異。因此，PSWY 可提高土壤磷素周轉庫容，增強土壤磷素轉化和供給能力，提高辣椒植株吸磷量，增產增收，為設施農業可持續發展提供了理論依據。