一種改善磁微粒化學發光項目CA72-4產品性能的方法

陳永奇，逯陣毫，馬明，李靜雯，王玉堂

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

癌癥抗原72-4（CA72-4）法是一種檢測腫瘤相關糖蛋白72（TAG-72）的免疫分析法，該抗原被發現是在某些腫瘤細胞群中表達的抗原［1-3］。抗原被鑒定為220～400 kDa 黏蛋白型糖蛋白［1,4］。抗體B72.3 最初是用轉移到肝臟的乳腺腫瘤的膜富集細胞提取物制備的，并已被證明能與TAG-72［3］反應。CC49 是TAG-72 特異性抗體。CC49 抗體和B72.3 抗體分別識別TAG-72 的Galβ（1-3）唾液酸-tn和唾液酸-tn 糖鏈表位［5-6］。有趣的是，CA72-4 在惡性胃癌、卵巢癌、結直腸癌和胰腺癌患者的血清或血漿中含量升高，并被用于監測胃腸道和黏液性卵巢癌患者［1,7-9］。血液測試可以為臨床醫生提供各種疾病跡象的信息。由于血液檢測的結果提高了診斷的準確性，診斷測定顯示準確的測量值對于臨床決策至關重要。直到20 世紀40 年代，標本都是用肉眼和人工檢測的。每次測試都很耗時，測試的準確性取決于技術人員的技能水平。20 世紀50 年代，隨著美國制造商自動分析儀的出現，全面的檢測自動化開始了。自動化技術的進步緩解了準確性和速度的問題。如今，全國醫療機構（醫院和臨床檢驗中心）的實驗室都有相當數量的標本，并在24 h 內進行檢測。免疫化學方法在醫學實驗室中被常規使用。電化學發光免疫分析（ECLIA）法和化學發光免疫分析（CLIA）法因其靈敏度高、背景低、操作簡單而廣泛應用于自動化分析儀中。然而，這兩種方法都受限于免疫化學反應對各種干擾的敏感性，如血清中的自體抗體、抗動物IgG 的嗜異抗體、交叉反應、溶血、高脂血癥和高膽紅素血癥。本文基于化學發光免疫分析法，采用一些手段排除交叉反應等干擾，提高檢測準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 小牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司，雅為生物公司等），魚明膠（Sigma 公司）磁微粒（Merck 公司，羧基磁珠，100 mg/mL）；包被抗體（鄭州伊美諾生物技術有限公司）；酶標抗體（鄭州伊美諾生物技術有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽 EDC（Sigma 公司）；N-羥基丁二酰亞胺 NHS（Sigma 公司）；磁微粒偶連緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 MES buffer；磁微粒穩定液：緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；酶結合物穩定液：緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；乙醇胺（Aladdin 公司）；高碘酸鈉（Sigma公司）；氰基硼氫化鈉（Sigma 公司）；精氨酸（Sigma 公司）。

1.1.2 主要儀器 全自動化學發光測定儀AutoLumo A2000 Plus（安圖生物）；電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器材有限公司）；振蕩器（TOPSCIEN 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 磁微粒試劑包被方法 在4 mL 玻璃瓶中分別加入0.1 mL 10%質量濃度羧基磁珠，1 mL 偶連緩沖液，震蕩5 min 后磁分離，將上述操作重復3 遍進行清洗，而后分別加入0.3 mL 0.1 mol/L EDC 溶液與0.3 mL 0.1 mol/LNHS 溶液（注：以偶連緩沖液進行溶解），室溫震蕩反應1 h；洗2 次后加入0.9 mL 磁微粒偶聯緩沖液和0.6 mg CA72-4抗體，并室溫震蕩反應2 h。最后加入乙醇胺60 μL 繼續反應30 min，使用磁微粒穩定液（根據不同方案，向磁微粒緩沖液中加入不同的穩定劑，穩定劑濃度為10 mg/mL），磁分離清洗3 次后定容至9 mL，2～8 ℃儲存。

1.2.2 酶結合物配制方法 配制酶結合物穩定液，根據不同方案，向從酶結合物緩沖液中加入不同的穩定劑，穩定劑濃度為10 mg/mL；再向上述配置好的穩定液中加入酶結合物，終濃度為1 μg/mL。充分混勻，2～8 ℃儲存。

1.2.3 測試模式 由機器按照上機文件進行測試，每次加入50 μL 校準品（濃度值為0 μIU/mL、5 μIU/mL、50 μIU/mL、100 μIU/mL、150 μIU/mL、300 μIU/mL）、20 μL 磁珠混懸液和100 μL 酶結合物以及100 μL 底物。具體過程使用A2000plus 儀器進行檢測，除磁珠混懸液其余均使用該公司在售試劑盒內組分。

1.2.4 檢測指標 穩定性指標：目前IVD 行業對化學發光試劑盒的穩定性的共識為在37 ℃下放置7 d 約等于試劑條件下在2～8 ℃存放8～12 個月，計算濃度點相對光單位（RLU）下降率ROD（%）=ABS（RLU37℃7d/RLU2～8℃-1）×100%，ROD 均 值為校準品各值的平均值，目前業內公認ROD 值小于10%為合格標準。

1.2.5 BSA 去糖基化方法 將BSA 用純化水配成50 mg/mL，充分攪拌，待其完全溶解后，向其中加入高碘酸鈉和精氨酸，高碘酸鈉及精氨酸的終濃度均為5 mg/mL，避光反應3 h。向其中加入氰基硼氫化鈉，終濃度為5 mg/mL，過夜反應。用PBS 緩沖液透析，過夜，透析液：PBS 緩沖液液＞1∶50。

2 結果

2.1 不同穩定劑對產品性能影響的結果

將魚明膠、BSA 加入穩定液（10 mg/mL）中，上機驗證產品CA72-4 反應性，結果如表1 所示。

表1 不同穩定劑對產品性能影響的結果比較

2.2 不同廠家BSA 對產品性能影響的結果

將不同廠家BSA 加入到穩定液中（10 mg/mL），上機驗證產品CA72-4 反應性，結果如表2 所示。

表2 不同廠家BSA 對產品性能影響的結果

2.3 去糖基化BSA 對產品性能影響的結果

將上述提到效價較優的BSA 進行去糖基化，加入到穩定液中，且對該產品進行穩定性考核，其結果如表3 所示。

表3 去糖基化BSA 對產品性能影響的結果

通過表2 和表3 數據進行對比，將BSA 去糖基化之后，本底有所降低，高濃度RLU 略微降低，但是澤龍20190739 批號的BSA 出現異常。除此之外，其它進行7D 熱加速穩定性考核，僅個別去糖基化BSA 作為穩定劑本底會升高，其它均較優。滿足項目需求。

3 討論

本文通過篩選常用的兩種穩定劑，確定BSA對RLU 影響較小，但是本底高。后期，筆者又對不同廠家的BSA 進行篩選，發現不同廠家BSA 對產品性能影響差異較大，綜合分析，可能是BSA上的糖基于抗體發生了交叉反應，因此本文對BSA 進行去糖基化，最終通過熱加速穩定性考核，本底降低，滿足項目需求。