基于兩樣本孟德爾隨機化研究探究ω-3脂肪酸與年齡相關性黃斑變性之間的因果關系

朱露,蔣洪湖,朱靜吟

復旦大學附屬華東醫院眼科,上海 200040

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是老年人視力障礙和視力喪失的主要原因。據統計,當前我國70歲及以上人群AMD的患病率為20.2%[1]。隨著我國人口老齡化程度加劇, AMD的患者數也在持續上升。臨床上常根據是否有新生血管將AMD分為干性AMD和濕性AMD[2]。目前,靶向血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療濕性AMD已取得重大突破,但對視力喪失的晚期AMD患者暫無有效的防治手段[3]。ω-3脂肪酸是生命活動所必需的多不飽和脂肪酸,包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等。由于人體內ω-3的轉化能力十分有限[4],因此經由飲食攝入豐富的EPA和DHA(如魚類和海產品)是獲得足夠ω-3脂肪酸的重要途徑。研究顯示,飲食中富含ω-3與較低風險的AMD相關[5]。然而,年齡相關性眼病研究2(Age-Related Eye Disease Study 2, AREDS2)[6]和營養性AMD治療2(Nutritional AMD Treatment-2, NAT-2)[7]發現,補充ω-3并不能防止AMD進展。孟德爾隨機化研究(Mendelian randomization study, MR)利用與暴露因素強相關的遺傳變異作為工具變量,評估暴露因素與結局之間的關系[8]。雖然ω-3會對AMD的發生發展產生影響,但是各項研究結果間存在很大的異質性。因此本研究采用兩樣本MR設計,將ω-3相關的遺傳變異作為工具變量,通過MR來研究ω-3與AMD是否存在關聯,以期為防治AMD發生發展提供循證依據。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究設定ω-3為暴露因素,以AMD和干性AMD為結局,使用兩樣本MR評估ω-3與AMD的因果效應。其中, ω-3數據來自IEU Open全基因關聯研究(genome-wide association, GWAS)數據庫(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/met-d-Omega_3/)。包括114 999例歐洲個體,單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism, SNP)數量為12 321 875個。AMD數據來自FinnGene研究(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-H7_AMD/)。截至2021年該數據包括3 763例AMD病例和205 359例對照, SNP數量為16 380 424個,人群年齡中位數為76.58歲(其中男性76.51歲,女性76.64歲)。干性AMD數據(https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-DRY_AMD/)包括2 469例干性AMD病例和206 221例對照, SNP數量為16 380 423個,人群年齡中位數為76.19歲(其中男性75.95歲,女性76.42歲)。見表1。

表1 兩樣本MR研究中GWAS數據庫

1.2工具變量SNP篩選從ω-3的GWAS數據庫中篩選出P<5×10-8的SNP。設置連鎖不平衡參數(R2=0.001,區域寬度10 Mb),確保選定的SNP之間相互獨立。從AMD的GWAS數據庫中提取與ω-3密切相關的SNP,將2組SNP數據集合并,同時移除與AMD直接相關(P<5×10-8)的SNP,去除存在回文變異的SNP?；匚淖儺惗x為相同的等位基因出現在正鏈和負鏈。本研究通過F=beta2/se2計算統計強度,避免出現弱工具偏倚,F>10定義為無弱工具偏倚,去除F<10的SNP[9]。

1.3兩樣本MR分析因果效應的主要估計方法為逆方差加權法(inverse-variance weighted, IVW),在無異質性和水平多效性存在的情況下,這種方法可以提供最準確的分析結果[10]。水平多效性定義為SNP通過與暴露無關的途徑影響結局。異質性定義為SNP之間的差異[11]。此外,本研究還使用了MR-Egger回歸和加權中位值(weighted median, WME)作為IVW結果的補充證據。當水平多效性和異質性存在的情況下,這2種方法可以提供相對準確的估計,本研究中更關注其方向和效應大小[12]。

1.4敏感性分析使用敏感性分析評估潛在的異質性和水平多效性是否對結果有顯著影響。Cochran’s Q檢驗評估SNP之間的差異,差異越小提示異質性越小,P<0.05表示具有異質性。通過MR-Egger回歸中SNP的截距評估潛在的水平多效性,若截距與0相隔較遠,則存在水平多效性,反之則無,P<0.05表示存在水平多效性。通過MR多效性殘差和離群值(MR pleiotropy residual sum and outlier, MR-PRESSO)檢驗中的全局測試檢測SNP中水平多效性和異常值的存在(P<0.05)。留一法逐一剔除SNP,并計算其余SNP的合并效應,以此評估每1個SNP對結局的效應[13]。

1.5統計學分析所有統計學分析均在R版本4.2.2中進行,比值比(odds ratio,OR)和95%置信區間(confidence interval,CI)用以估計由暴露存在引起的相對風險[13]。P<0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1工具變量共有49個SNP納入本研究,所有SNP與ω-3密切相關(P<5×10-8),F統計量均>10,提示49個SNP均為有效工具變量,而由弱工具變量所造成的偏倚不會對MR分析的因果推斷產生影響。

2.2兩樣本MR分析結局為AMD的兩樣本MR分析, IVM結果顯示遺傳預測的ω-3水平與AMD風險降低相關(OR=0.837, 95%CI: 0.747～0.937,P=0.002)。結局為干性AMD的兩樣本MR分析, IVM結果顯示遺傳預測的ω-3水平與干性AMD風險降低相關(OR=0.837, 95%CI: 0.735～0.953,P=0.007)。MR-Egger回歸和WME結果顯示OR<1,提示因果效應方向一致。見表2。

表2 ω-3與AMD風險之間的關聯

2.3敏感性分析Cochran’s Q檢驗結果顯示, SNP之間無異質性(PAMD=0.295,P干性AMD=0.473)。漏斗圖顯示納入的SNP基本對稱,提示因果關聯受到潛在偏倚的影響較小。MR-Egger回歸的截距顯示不存在水平多效性(PAMD=0.515,P干性AMD=0.785),說明SNP只能通過ω-3影響AMD。MR-PRESSO檢驗未檢測到異常的SNP,且不存在水平多效性(PAMD=0.234,P干性AMD=0.437)。逐個剔除SNP后IVW分析結果與全部SNP的分析結果相似,提示不存在對因果效應影響較大的SNP。見表3。

表3 ω-3與AMD風險之間關聯的敏感性分析

3 討論

本次研究結果顯示, ω-3水平與AMD風險降低相關(OR=0.837, 95%CI: 0.747～0.937,P=0.002); ω-3水平與干性AMD風險降低相關(OR=0.837, 95%CI: 0.735～0.953,P=0.007)。與傳統的觀察性研究和隨機對照試驗相比, MR是一種兼具靈活性和穩健性的統計方法,通過使用遺傳變異作為工具變量,從而減少觀察性研究中的混雜、反向因果關系和回歸稀釋偏倚。該研究中的ω-3數據來自IEU Open GWAS數據集, AMD數據來自FinnGene研究,以上數據人群分層相對集中,且病例群體主要為76歲左右的老年人,上述因素可以最大限度減少人群分層偏差的可能性,這種相似性提升了兩樣本MR假設的可行性,即遺傳關聯結果是從相同或可比人群的樣本中獲得的[14]。此外,通過MR-Egger回歸分析和MR-PRESSO檢驗來估計效果,為驗證研究結果的非水平多效性提供了依據。MR-Egger回歸截距顯示不存在水平多效性(PAMD=0.515,P干性AMD=0.785), MR-PRESSO檢驗顯示未檢測到異常SNP且不存在水平多效性(PAMD=0.234,P干性AMD=0.437),以上結果提示所篩選的49個SNP只能通過ω-3影響AMD及干性AMD。

ω-3對視網膜結構的保護具有重要作用[15], DHA在光感受器的膜上富集達到最高濃度,對光感受器的分化和存活以及視網膜功能具有重要影響。而炎癥因子也是AMD的發病因素之一[16], EPA和DHA的抗炎特性[17]對AMD有益。ω-3可能會增加黃斑色素密度,這種色素可以過濾藍光,并具有局部抗氧化和抗炎活性[18],對黃斑區視網膜有保護作用。而在AREDS2[6]和NAT-2[7]中發現,單純補充ω-3并不能直接預防AMD進展?？紤]AREDS2中的樣本量是基于AREDS的預期進展率所獲得,研究將試驗組相較于安慰劑組進展為晚期AMD的發生率減少25%定義為有意義,如補充ω-3的有益效能低于AREDS的預期進展率,則AREDS2顯示結果無意義[19]。此外, AREDS2中超過60%的受試者受過本科及以上教育,日常飲食營養豐富;而對照組中超過11.1%的受試者自行服用ω-3,違反了協議指導方針,這些受試者并未按照干預組管理細則進行進一步分類,這種錯誤分類可能導致主要結果無效[20]。事實上, AREDS2受試者的一些關鍵基線營養參數(包括血清葉黃素、玉米黃質、 DHA和EPA)高于一般人群,以上干擾因素并未在AREDS2研究中排除[6]。而在NAT-2中假設DHA組和安慰劑組3年內發生脈絡膜新生血管形成(choroidal neovascularization, CNV)的風險分別為19.8%和33.0%,檢驗效能為80.0%,計算樣本量。DHA組3年以上CNV發生率(28.4%)高于預期,安慰劑組3年以上CNV發生率(25.6%)低于預期,其樣本量估算的參數設置不合理,不符合臨床實際情況,這可能導致主要結果無效[7]。此外, NAT-2補充分析發現DHA對CFH Y402H非風險等位基因純合的患者有顯著保護作用(HR=0.14, 95%CI: 0.03～0.59,P=0.008),但DHA對純合子(HR=2.33, 95%CI: 0.98～5.55,P=0.06)或雜合子風險等位基因(HR=1.19, 95%CI: 0.56～2.51,P=0.65)均無顯著影響[21]。可見補充DHA和CNV之間的聯系可能受到遺傳易感性的影響,特別是與CFH Y402H變異有關, CFH Y402H所賦予的AMD遺傳易感性可能限制DHA補充劑所提供的益處。膳食補充劑ω-3配伍的不同也可影響人體的生物利用度,例如AREDS2中DHA與EPA的比例為1∶2,而NAT-2中DHA與EPA的比例3∶1。

AMD是導致老年人失明的主要原因,55歲以上人群的發病率與年齡呈正相關[22]。中國約有500多萬AMD患者,隨著我國經濟、醫療水平和平均預期壽命的提高, AMD的患病率一直在上升[2]。AMD嚴重影響患者視力功能,致使其閱讀和駕駛等重要活動減少,抑郁和情緒障礙等疾病發生率增加[22]。治療AMD的首要目標是提高視功能,最大限度減少患者視力喪失或延緩病情進展。AMD的主要非遺傳危險因素是年齡、高血壓、高膽固醇血癥、吸煙、缺乏運動、肥胖和飲食中抗氧化劑的低攝入[22]。AMD相關的主要遺傳變異是補體因子H(complement factor H, CFH)和補體因子I,補體成分C2、 C3以及年齡相關性黃斑病變易感基因2[23]。根據眼底表現, AMD分為濕性AMD和干性AMD,濕性AMD約占AMD的10%,可通過玻璃體注射抗VEGF藥物治療,然而對于更常見的干性AMD尚無有效的藥物[24]。針對危險因素中抗氧化劑的低攝入,研究者選用類胡蘿卜素、姜黃素、鋅、ω-3等營養素作為膳食補充劑,結果證實類胡蘿卜素(即葉黃素和玉米黃質)與ω-3的膳食補充組合對延緩或改善早/中期AMD患者進展的效果最好[25]。此外,有證據表明攜帶AMD不同風險等位基因的患者可能受益于個性化營養補充[23]。然而目前對遺傳表型和不同營養補充劑對AMD的進展影響了解仍十分有限。高分辨率視網膜成像技術的進步使AMD在體內可以精確表型,結合臨床病理和遺傳相關性,強調了AMD的異質性。目前眾多學者認為AMD代表一種由不同表型和不同發病機制組成的疾病譜[3]。綜上,針對特定的表型和階段量身定制營養支持方法,可能是未來預防AMD發生發展的有效措施,但需更多臨床研究數據來驗證。

本研究通過兩樣本MR探討ω-3是否對AMD有影響,結果與ω-3對黃斑區視網膜的保護作用一致,提示AMD患者可能缺乏ω-3的保護,而通過補充劑或飲食富集提供ω-3,可能有助于延緩AMD的發生發展。然而本研究仍有局限性:(1)研究無法精準評估EPA、 DHA等ω-3脂肪酸與AMD之間的因果關聯; (2)ω-3的GWAS效應大小是基于血漿濃度計算的,無法準確反映細胞膜的ω-3濃度,這些膜濃度可能會直接影響AMD的風險[7]; (3)鑒于難以直接確定飲食對AMD的因果關系,需要更多高水平研究來驗證ω-3對各類AMD亞型的具體影響。鑒于現有研究的局限性和結果的多樣性,亟待確定ω-3補充需要的劑量和維持時間等對各類型AMD患者的影響,進而為改善AMD患者生活質量提供臨床診療思路。