D-半乳糖誘導(dǎo)青年樹鼩卵巢衰老*

田川葉麗趙曉娟朱向情趙晶阮光萍潘興華

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,昆明 650032)

卵巢作為衰老最敏感的器官之一,可隨年齡增長而自然衰老,也可因疾病、感染、中毒等導(dǎo)致卵巢衰老,引起女性內(nèi)分泌紊亂和全身組織器官結(jié)構(gòu)退變以及功能衰退,導(dǎo)致女性不孕,并使卵巢衰老相關(guān)疾病高發(fā)[1]。卵巢衰老是一個(gè)長期而復(fù)雜的過程,其與神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、氧化應(yīng)激、遺傳易感、線粒體受損等因素有關(guān),然而,目前多因素導(dǎo)致卵巢衰老的分子機(jī)制并不完全清楚[2]。可見,一個(gè)合適的模式生物將有助于研究人員探索卵巢功能下降的危險(xiǎn)因素和闡明其分子機(jī)制,并有助于預(yù)防或延緩卵巢衰老過程[3]。而樹鼩的遺傳、解剖、生理、神經(jīng)、免疫等與人類相對接近,比現(xiàn)有的中小型實(shí)驗(yàn)動物更接近于人類,比獼猴等靈長類實(shí)驗(yàn)動物成本低,用于實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果對人類有較大參考價(jià)值[4-5]。此外,樹鼩的體質(zhì)量、體積均與大、小鼠相接近,實(shí)驗(yàn)操作方便,易于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究[6]。因此,樹鼩卵巢衰老模型是研究卵巢衰老的理想模型。

D-半乳糖(D-galactose,D-gal)作為一種還原糖,可通過半乳糖激酶和半乳糖1磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶分解為葡萄糖代謝,使活性氧過度累積,破壞基因組的穩(wěn)定性,引起氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡[7]。此外,D-gal可與蛋白質(zhì)、氨基酸等游離基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),形成晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE),AGE通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體和其他受體結(jié)合,在卵巢顆粒、葉黃素和單核細(xì)胞等表面積聚,促進(jìn)炎性反應(yīng),加速卵巢衰老。因此,D-gal被廣泛用于抗衰老藥物開發(fā)的動物模型研究。基于以上研究結(jié)果,本研究以樹鼩來作為卵巢衰老的研究對象,利用D-gal誘導(dǎo)法,通過觀測卵巢組織結(jié)構(gòu)、增殖活性、細(xì)胞凋亡和衰老相關(guān)標(biāo)志分子等指標(biāo),評價(jià)、建立卵巢衰老模型,可為卵巢衰老的研究提供技術(shù)參考方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:SPF級雌性青年樹鼩(n=8)購買自中國科學(xué)院昆明動物研究所,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(滇)K2017-0003】,平均年齡3.5歲,體質(zhì)量130～160 g,飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室,其環(huán)境清潔、衛(wèi)生,達(dá)到動物飼養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號【SYXK(軍)2017-0051】,實(shí)驗(yàn)動物倫理審批號為:倫審2021-055(科)-01。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材:通用型中性組織固定液、HE染液(Servicebio)、Masson 染液(均Servicebio);Tunel 試劑盒(Vazyme);無水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);IX70-121倒置相差顯微鏡(Olympus);冰凍切片機(jī)(Thermo);D-gal(Sigme, G0750-50G)。

1.2 方法

1.2.1D-gal溶液配制及頸背部皮下給藥:電子天平稱取適量的D-gal粉末,倒入500 mL燒杯中加入無菌注射用水,用磁力攪拌器攪拌至透明,并配制成30%的D-gal溶液,于50 mL無菌離心管中備用。8只青年樹鼩經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)、觀察無異樣后,隨機(jī)分為對照組(n=4)與模型組(n=4),D-gal溶液按2.5 mL/g的劑量,給予模型組樹鼩頸背部皮下注射,每天1次,連續(xù)給藥5個(gè)月。

1.2.2HE染色:石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min,加雙蒸水沖洗3次。蘇木精染液染4 min,雙蒸水沖洗3次,分化液處理5 min,加雙蒸水沖洗3次,返藍(lán)液處理5 min,加雙蒸水沖洗3次。切片依次放入85%和95%乙醇脫水5 min,伊紅染液處理5 min。切片依次放入無水乙醇I 5 min、無水乙醇II 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明。中性樹膠封片。熒光倒置顯微鏡下觀測、拍照。

1.2.3Ki67染色:切片依次放入環(huán)保型脫蠟液Ⅰ10 min、環(huán)保型脫蠟液Ⅱ10 min、環(huán)保型脫蠟液Ⅲ 10 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、ddH2O2沖洗。抗原修復(fù),PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5 min。組織周圍畫圈,加血清封閉30 min。加一抗(Ki67,1∶200),濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗滌3次,每次5 min。加對應(yīng)的二抗(CY3山羊抗兔,1∶200),避光室溫孵育50 min。PBS洗滌3次,每次5 min,加DAPI染液,避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次,每次5 min,加自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min,ddH2O2沖洗10 min。加抗熒光淬滅封片劑封片。采集圖像。

1.2.4Tunel染色:切片37 ℃烘箱烘烤15 min,4%多聚甲醛固定 30 min,PBS(pH 7.4)洗滌 3 次,每次5 min。組織周圍畫圈并加蛋白酶K工作液,37 ℃溫箱孵育25 min。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加破膜液室溫孵育20 min,PBS洗滌3次,每次5 min。加1×平衡緩沖液室溫孵育 10 min。加重組末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶、BrightRed Labeling Mix、5×平衡緩沖液和ddH2O2的混合液,37 ℃孵育2 h。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加 DAPI 染液室溫避光孵育10 min。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片。熒光倒置顯微鏡下觀測、拍照。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 :切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min后,雙蒸水沖洗3次。EDTA抗原修復(fù)液處理5 min,中火8 min、停火8 min、低火7 min。PBS洗滌3次,每次5 min。組織周圍滴加BSA孵育30 min,加一抗(P53/21/16)4 ℃過夜,PBS洗滌3次后,每次5 min。二抗孵育60 min。抗熒光淬滅封片劑封片。DAPI染液孵育10 min。PBS洗滌3次,每次5 min,再用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織結(jié)構(gòu)變化

對照組樹鼩卵巢組織細(xì)胞排列整齊,間質(zhì)和髓質(zhì)界限明顯,可見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍(lán)色箭頭)、次級卵泡(橙、綠色箭頭)、成熟卵泡(紫色箭頭),并有可見少量閉鎖卵泡(深藍(lán)色箭頭)。模型組樹鼩卵巢組織細(xì)胞排列散亂,間質(zhì)和髓質(zhì)界限模糊,局部只見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍(lán)色箭頭)、次級卵泡(橙色箭頭)且其數(shù)量顯著低于對照組樹鼩,還可見大量閉鎖卵泡(深藍(lán)色箭頭)(圖1)。

注:黑色箭頭:原始卵泡;藍(lán)色箭頭:初級卵泡;橙、綠色箭頭:次級卵泡;紫色箭頭:成熟卵泡;深藍(lán)色箭頭:閉鎖卵泡。Note:Black arrow:primitive follicles;blue arrow:primary follicles;Orange,green arrow:secondary follicles; purple arrow:mature follicles;dark blue arrow: atretic follicles.圖1 卵巢組織HE染色Fig.1 HE staining of ovarian tissue

2.2 P53、P21、P16蛋白表達(dá)

P53、P21、P16標(biāo)記的細(xì)胞,藍(lán)色為細(xì)胞核。結(jié)果顯示,模型組可見大量P53、P21、P16標(biāo)記的棕褐色細(xì)胞,而對照組局部只見少量棕褐色細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,模型組P53、P21、P16標(biāo)記的陽性細(xì)胞率顯著高于對照組,表明模型組卵巢組織中P53、P21、P16的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組(圖2)。

*P<0.01,**P<0.001圖2 卵巢組織免疫組織化學(xué)染色Fig.2 Immunohistochemical staining of ovarian

2.3 細(xì)胞分裂增殖

Ki67標(biāo)記的細(xì)胞,藍(lán)色為細(xì)胞核被。Ki67染色結(jié)果顯示,對照組成熟卵泡中可見大量紅色熒光,而模型組局部只見少量紅色熒光,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明,對照組Ki67標(biāo)記的陽性細(xì)胞率顯著高于模型組(圖3)。

*P<0.001圖3 卵巢組織Ki67染色Fig.3 Ki67 staining of ovarian

2.4 細(xì)胞凋亡

紅色為凋亡的細(xì)胞,藍(lán)色為細(xì)胞核。結(jié)果顯示,對照組樹鼩卵巢局部只見少量紅色熒光,而經(jīng)D-gal背頸部注射5個(gè)月后可見有大量紅色熒光出現(xiàn),表明對照組樹鼩卵巢僅有少量細(xì)胞凋亡,模型組樹鼩卵巢有大量細(xì)胞凋亡(圖4)。

*P<0.01圖4 卵巢組織Tunel染色Fig.4 Tunel staining of ovarian

3 討論

目前,多種因素導(dǎo)致卵巢衰老的女性人群不斷增多,而針對卵巢衰老的治療方法多是延緩疾病發(fā)展,并不能從根本上解決卵巢衰老誘發(fā)的內(nèi)分泌紊亂、多組織器官結(jié)構(gòu)衰退和不孕等問題,且會伴隨相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生,如激素替代治療會引起乳腺癌、血栓和卵巢癌等病發(fā),究其原因部分是因?yàn)橐鹇殉菜ダ详P(guān)鍵的細(xì)胞和分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。獲得與人類更為接近的卵巢衰老模型是解析卵巢衰老發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵要素之一。因此,樹鼩屬于非人類靈長類動物,其遺傳和生理生化等與人類相近,通過D-gal誘導(dǎo)法建立樹鼩卵巢衰老模型,獲得的研究結(jié)果將對女性卵巢衰老治療具有更重要的參考價(jià)值。

卵巢衰老被認(rèn)為是以卵泡數(shù)量逐漸減少為主導(dǎo)的,這與卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降相一致[8]。卵巢衰老的典型特征是組織結(jié)構(gòu)破壞、卵母細(xì)胞數(shù)量減少且質(zhì)量降低、卵泡閉鎖。衰老作為一個(gè)漸進(jìn)的、不可逆轉(zhuǎn)的病理生理過程,表現(xiàn)為組織和細(xì)胞功能下降,各種與衰老相關(guān)的疾病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[9]。本研究的HE結(jié)果顯示,青年健康雌性樹鼩經(jīng)D-gal溶液行頸背部注射5個(gè)月后,卵巢組織細(xì)胞排列散亂,局部只見少量原始卵泡和初級卵泡,并有大量閉鎖卵泡。在小鼠模型上,通過連續(xù)皮下注射D-gal約6周已被證明可以加速大腦、腎、肝衰老,降低血漿中抗苗勒氏激素(AMH),誘導(dǎo)卵巢衰老[10]。這和本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,提示D-gal溶液經(jīng)頸背部給藥可使青年樹鼩卵巢組織結(jié)構(gòu)破壞、卵泡閉鎖。

激活P53-P21-和P16依賴的DNA損傷反應(yīng)可減弱細(xì)胞的增殖能力,加速細(xì)胞衰老。研究表明,腫瘤蛋白P53可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡來決定DNA損傷檢查點(diǎn)反應(yīng)的結(jié)果,故在DNA損傷反應(yīng)中起核心作用,包括對細(xì)胞衰老、基因組不穩(wěn)定、線粒體功能障礙和代謝途徑改變等調(diào)控方面扮演重要角色[11]。P21作為細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子,它可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和特定的細(xì)胞周期蛋白形成復(fù)合物,在特定階段誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,穩(wěn)定P21蛋白表達(dá),可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期[12]。僅P21就足以驅(qū)動細(xì)胞衰老程序,包括轉(zhuǎn)錄組改變、DNA損傷、線粒體功能障礙和衰老相關(guān)的分泌表型[13]。P16細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子是最經(jīng)典的衰老生物標(biāo)志物之一,因?yàn)樗谂咛グl(fā)育早期被抑制,在衰老過程中逐漸被激活,在細(xì)胞衰老和干細(xì)胞動力學(xué)等導(dǎo)致衰老的關(guān)鍵細(xì)胞命運(yùn)決定中起著至關(guān)重要的作用[14]。P16抑癌基因在衰老組織中積聚,是細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物,其在體內(nèi)限制干細(xì)胞的功能[15]。本實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比較,模型組卵巢組織中P53、P21、P16的蛋白表達(dá)水平均顯著升高,提示了青年雌性健康樹鼩經(jīng)D-gal溶液行背頸部給藥5個(gè)月,可誘導(dǎo)卵巢組織細(xì)胞衰老。

Ki67是細(xì)胞周期進(jìn)程和進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)以來的時(shí)間的分級標(biāo)記,作為一種和細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì),可間接反映細(xì)胞增殖活性[16],Ki67染色在臨床上被廣泛用作增殖指標(biāo)。因此,我們利用Ki67染色來觀測經(jīng)D-gal干預(yù)后細(xì)胞的增殖活性,結(jié)果顯示,對照組細(xì)胞增殖活性顯著高于模型組。有研究在單細(xì)胞水平觀測內(nèi)源性調(diào)控下Ki67水平隨時(shí)間的變化,發(fā)現(xiàn)Ki67的積聚只發(fā)生在S、G2和M期[16]。

卵母細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵巢功能不全[17],顆粒細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致卵泡閉鎖[18]。卵巢卵泡池的大小受細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié),前者是導(dǎo)致生理性下降的原因,后者在青春期前的生理性卵泡池縮小中起主要作用[19]。也有研究表明,衰老的卵泡間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的與衰老相關(guān)的分泌表型相關(guān)的細(xì)胞分泌趨化因子配體,可能通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡而在卵巢衰老過程中損害卵泡的發(fā)育和成熟[20]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青年健康樹鼩經(jīng)D-gal溶液行頸背部注射給藥5個(gè)月后,TUNAL染色結(jié)果顯示卵巢組織細(xì)胞凋亡率明顯增加,且模型組樹鼩卵巢組織可見大量的閉鎖卵泡。有研究發(fā)現(xiàn)[21],在D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老的轉(zhuǎn)錄與代謝譜研究中,D-半乳糖對衰老的影響可能與糖和脂代謝紊亂、氧化損傷、晚期糖基化終末產(chǎn)物的積累和細(xì)胞凋亡顯著相關(guān)[21]。這些研究結(jié)果提示了D-gal可誘導(dǎo)卵巢衰老,而這可能是由于卵巢細(xì)胞凋亡增加所導(dǎo)致的。

綜上所述,可見D-半乳糖按8 g/kg的劑量給予青年樹鼩頸背部皮下注射給藥5個(gè)月,可使卵巢組織結(jié)構(gòu)散亂,衰老標(biāo)志分子P53、P21、P16蛋白表達(dá)上調(diào),使細(xì)胞分裂增殖能力減弱,細(xì)胞凋亡率增加,從而誘導(dǎo)卵巢衰老。