仙靈骨葆膠囊對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨強(qiáng)度的影響*

高玉海 謝高倩 孫 薇 吳 西 王中琪柏 鑫 魏 朋 王龍飛 陳克明

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050)(2.甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050) (3.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科,成都 610083)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種常見(jiàn)的全身代謝性骨病,主要表現(xiàn)為骨密度與骨質(zhì)量的下降,增加了患者發(fā)生脆骨性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1]。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái),老年性骨質(zhì)疏松患者數(shù)量急劇上升,是衛(wèi)生系統(tǒng)所面臨的巨大挑戰(zhàn)[2]。峰值骨量(peak bone mass,PBM)指人的一生中骨量所達(dá)到的最大值,PBM出現(xiàn)在青壯年時(shí)期,此后骨量開(kāi)始逐漸下降[3]。PBM的水平與OP的發(fā)生關(guān)系密切,提高青年時(shí)期PBM能延緩后期骨流失速度,對(duì)預(yù)防OP的發(fā)生具有一定作用。傳統(tǒng)中藥治療OP歷史悠久,以淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂和地黃為主要成分的仙靈骨葆膠囊作為治療OP的中藥復(fù)方,是廣大OP患者的選擇之一[4]。許多研究表明,仙靈骨葆膠囊能提高OP大鼠骨密度與骨生物力學(xué)性能、改善骨微結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對(duì)OP大鼠的骨保護(hù)作用[5-7]。但靈骨葆膠囊作用于生長(zhǎng)期大鼠的研究至今鮮有報(bào)道,本研究以生長(zhǎng)期大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,確定靈骨葆膠囊是否具有提高其骨強(qiáng)度的能力,探究靈骨葆膠囊是否具有提高生長(zhǎng)期大鼠PBM來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松的潛力,對(duì)OP的預(yù)防研究具有一定的參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器:仙靈骨葆膠囊(國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂貴州制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào):200804);4%多聚甲醛中性組織固定液與HE染液(武漢塞維爾生物科技有限公司);骨鈣素(OCN)定量檢測(cè)試劑盒與抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)定量檢測(cè)試劑盒(泉州睿信生物科技有限公司);Prodigy型雙能X線骨密度儀(GE公司);AG-IS萬(wàn)能臺(tái)式力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(島津公司);SkyScan1276型micro CT(Bruker公司)。

1.1.2動(dòng)物與分組:20只1月齡體質(zhì)量(130±10)g的SPF級(jí)SD雌性大鼠購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和仙靈骨葆組,每組10只。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證編號(hào)【SYXK(軍)2017-0047】,實(shí)驗(yàn)期間飲水自由,不限制進(jìn)食。仙靈骨葆組每天給予378 mg/kg的仙靈骨葆灌胃給藥,對(duì)照組每天給予等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間每周測(cè)1次大鼠體質(zhì)量,每?jī)芍軠y(cè)一次全身骨密度,待給藥6周組別間出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)安樂(lè)死所有大鼠并開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1臟器病理學(xué)分析:處死大鼠后迅速剝離心臟、肝、脾、肺和腎,清除周圍黏附組織后保存于10%多聚甲醛固定液中。石蠟包埋后切片再經(jīng)HE染色,顯微鏡下觀察有無(wú)病理學(xué)改變。

1.2.2骨密度檢測(cè):將大鼠麻醉后,放于雙能X線骨密度儀上測(cè)量全身骨密度。給藥6周安樂(lè)死大鼠后,取出左側(cè)股骨和椎骨剝離周圍多余肌肉,方向統(tǒng)一地?cái)[放于雙能X線骨密度儀上測(cè)量離體骨密度。測(cè)量結(jié)束后將椎骨用浸潤(rùn)0.9%氯化鈉溶液的紗布包裹保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.3生物力學(xué)檢測(cè):處死大鼠后,剝離右側(cè)股骨用紗布擦去多余組織后置于AG-IS萬(wàn)能臺(tái)式力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上,在跨距為15 mm、加載速度為2 mm/min的條件下進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn);從冰箱中取出用紗布包裹的椎骨,剪取第5腰椎,將其修剪為上下平整的圓柱體,立于AG-IS萬(wàn)能臺(tái)式力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上,在加載速度為2 mm/min的條件下進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Micro CT分析:安樂(lè)死大鼠后剝離左側(cè)脛骨,存放于4%多聚甲醛中性組織固定液中。進(jìn)行micro CT分析時(shí),將脛骨取出擦拭干凈周圍液體后,用紙巾包裹后置于micro CT實(shí)驗(yàn)機(jī)中。在電流200 μA、電壓85 kV、掃描分辨率為10 μm的條件下進(jìn)行掃描分析,并通過(guò)三維重建軟件NRecon進(jìn)行重建得到最大剖面圖與骨形態(tài)量化指標(biāo)。

1.2.5血清生化指標(biāo)檢測(cè):待大鼠麻醉成功后,采用腹主動(dòng)脈法收集血液,靜置1 h后4 000 r/min離心15 min,吸取上清凍存于-80 ℃冰箱。進(jìn)行血清生化指標(biāo)檢測(cè)時(shí),將血清與試劑盒提前放于室溫自然解凍,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)骨形成指標(biāo)骨鈣素(osteocalcin,OCN)與骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b,TRACP-5b)含量,單位為ng/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 仙靈骨葆對(duì)大鼠體質(zhì)量和臟器的影響

如圖1所示,實(shí)驗(yàn)期間兩組大鼠體質(zhì)量都呈上升趨勢(shì),組別間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。6周后剝離出新鮮的心臟、肝、脾、肺和腎,經(jīng)肉眼觀察并無(wú)發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)與色澤上的改變。顯微鏡下觀察各臟器的病理切片,并未發(fā)現(xiàn)明顯病變,見(jiàn)圖2。

圖1 大鼠體質(zhì)量變化情況Fig.1 Change in body mass of

圖2 主要臟器組織病理學(xué)檢查結(jié)果(標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 Histopathological examination results of main organs(scale bar=100 μm)

2.2 仙靈骨葆對(duì)大鼠骨密度的影響

給藥第2周和第4周時(shí),組別間全身骨密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),第6周時(shí)仙靈骨葆組全身骨密度與對(duì)照組相比有顯著上升(P<0.05),股骨骨密度和椎骨骨密度也都顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖3,4。

注:與對(duì)照組相比較,*P<0.05。Note: Compared with the control group,*P<0.05.圖3 大鼠全身骨密度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Bone mineral density test results of

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。Note: Compared with the control group,*P<0.05.圖4 大鼠離體骨密度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 In vitro bone mineral density

2.3 仙靈骨葆對(duì)大鼠生物力學(xué)性能的影響

股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,仙靈骨葆組最大載荷和屈服強(qiáng)度顯著提高(P<0.05),彈性模量也有所提高(表1);椎骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:仙靈骨葆組最大載荷相比于對(duì)照組有顯著提高(P<0.05),彈性模量也有明顯提高(表2)。

表1 股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of three-point bending test of

表2 椎骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Compression test results of

2.4 仙靈骨葆對(duì)大鼠micro CT掃描結(jié)果的影響

如圖5所示,與對(duì)照組相比,仙靈骨葆組脛骨內(nèi)骨小梁更加密集,且連續(xù)性與延展性更好。量化結(jié)果顯示,仙靈骨葆組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),骨小梁分離度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表3)。

表3 脛骨micro CT量化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of quantitative indexes of micro CT in

圖5 脛骨micro CT成像分析最大剖面圖Fig.5 Maximum section of micro CT imaging analysis of tibia

2.5 仙靈骨葆對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

如圖6所示,仙靈骨葆組血清OCN含量高于對(duì)照組(P<0.01),血清TRACP-5b含量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注:與對(duì)照組相比較,*P<0.01。Note: Compared with the control group,*P<0.01.圖6 血清OCN含量和血清TRACP-5b含量Fig.6 The content of OCN and TRACP-5b

3 討論

仙靈骨葆膠囊為純中藥制劑,是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)證的非處方傳統(tǒng)中藥,臨床上常常用于骨質(zhì)疏松、骨折和股骨頭壞死等的治療[8-10]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,仙靈骨葆膠囊能緩解OP大鼠的骨流失情況,改善骨密度與骨質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)對(duì)OP大鼠骨強(qiáng)度的保護(hù)[5-7]。但仙靈骨葆膠囊作用于生長(zhǎng)期大鼠的相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以生長(zhǎng)期大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探究仙靈骨葆膠囊是否能提高生長(zhǎng)期大鼠的骨強(qiáng)度,推測(cè)其是否具有提高峰值骨量來(lái)預(yù)防OP的潛力。

骨組織的健康水平由骨強(qiáng)度決定,因此提高峰值骨量預(yù)防骨質(zhì)疏松的前提是加強(qiáng)骨骼骨強(qiáng)度。骨密度和骨質(zhì)量共同影響著骨強(qiáng)度,決定了骨骼的健康[11]。骨密度檢測(cè)能預(yù)測(cè)骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),骨密度值是診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。骨密度結(jié)果顯示,在仙靈骨葆的作用下,全身骨密度、股骨骨密度與椎骨骨密度均有明顯提高,說(shuō)明仙靈骨葆能有效增高生長(zhǎng)期大鼠骨密度。骨生物力學(xué)指外界力學(xué)刺激下骨的生物學(xué)效應(yīng),反映了骨骼的強(qiáng)度、韌性及抗骨折能力,是評(píng)價(jià)骨質(zhì)量的重要指標(biāo)[13]。股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果與椎骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,仙靈骨葆能優(yōu)化生長(zhǎng)期大鼠生物力學(xué)性能,從提高骨骼硬度、韌性及承受力等方面提高生長(zhǎng)期大鼠的骨質(zhì)量。Micro CT分析得到的最大剖面圖直觀的體現(xiàn)了骨質(zhì)量好壞,本次實(shí)驗(yàn)中仙靈骨葆明顯優(yōu)化了骨微結(jié)構(gòu),增加了骨小梁的數(shù)量、密度以及厚度,量化結(jié)果呈現(xiàn)相同結(jié)果。提示仙靈骨葆能從優(yōu)化骨骼微觀結(jié)構(gòu)的角度提高生長(zhǎng)期大鼠骨質(zhì)量。血清生化指標(biāo)直接體現(xiàn)了骨代謝情況,OCN作為公認(rèn)的骨形成指標(biāo)代表了成骨細(xì)胞的活性,TRACP-5b作為骨吸收指標(biāo)反映了破骨細(xì)胞活性[14]。本實(shí)驗(yàn)血清檢測(cè)結(jié)果顯示,仙靈骨葆能提高OCN含量的同時(shí)降低TRACP-5b含量,說(shuō)明仙靈骨葆能從改變骨轉(zhuǎn)化率的角度提高生長(zhǎng)期大鼠骨質(zhì)量。

綜上所述,骨密度和骨質(zhì)量的共同提高表明了仙靈骨葆對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨強(qiáng)度的提高作用,且仙靈骨葆可能通過(guò)抑制骨吸收與促進(jìn)骨形成來(lái)提高骨強(qiáng)度。提示仙靈骨葆具有提高生長(zhǎng)期大鼠峰值骨量來(lái)預(yù)防OP的潛力。本研究從預(yù)防骨質(zhì)疏松的角度為廣大學(xué)者提供了新思路,但其“應(yīng)用價(jià)值如何?與現(xiàn)有預(yù)防OP的天然藥物或化合物相比有何優(yōu)勢(shì)?”等問(wèn)題都有待進(jìn)一步研究。