木香烴內酯對生長期大鼠骨強度的影響*

魏 朋 謝高倩 高玉海 何玥穎 秦 昆 陳 卓 柏 鑫 陳克明

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院基礎醫學實驗室,蘭州 730050)(2.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室,蘭州 730050)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以低骨量和骨結構破壞,導致骨強度下降和骨折風險增加為特征的慢性疾病[1]。老年群體是發生骨質疏松的主要群體,一旦發生骨質疏松性骨折將會給患者帶來嚴重的傷害[2]。隨著我國老年人口的比例不斷增加,如何防治骨質疏松成為一個亟待解決的難題。目前治療骨質疏松的藥物以西藥為主,但大多存在一定的毒副作用且價格昂貴[3]。中藥由于藥性溫和,毒副作用小且具有價格低廉等特點,已成為當前抗骨質疏松藥物研究的熱點之一。木香烴內酯(costunolide, CT)是屬于倍半萜內酯,最早從傳統中藥木香中提取,現已發現其具有多種生物活性[4-7]。本課題組在前期研究中發現CT能誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,初步證明其具有促進骨形成能力[8],本研究旨在探究灌服CT對生長期大鼠的骨密度及其他骨強度相關指標的影響,為開發源自CT的抗骨質疏松新藥奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:1月齡雌性SD大鼠30只,SPF級,體質量(99±3)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,實驗動物生產許可證號【SCXK(京)2019-00010】。飼養于聯勤保障部隊第940醫院SPF級動物實驗中心,實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2017-0047】。自由飲食飲水,室溫為(22±2)℃,相對濕度為45%～65%。

1.1.2實驗藥品:木香烴內酯,純度為98.74%,適宜保存溫度為2～8 ℃,購買于成都埃法生物科技有限公司,批號:AF21052201。

1.1.3儀器:AE200電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);雙能X線骨密度(bone mineral densities,BMD)儀(GE公司);AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司);NMC-100 Micro-CT儀【平生醫療科技(昆山)有限公司】。

1.2 方法

1.2.1分組及給藥:SD大鼠隨機分為3組,每組10只,分別為對照組(Control)、木香烴內酯低劑量組(Costunolide, CT-9)和高劑量組(Costunolide, CT-18)。CT組分別按9 mg/(kg·d)和18 mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥,Control組僅灌服等量蒸餾水。每周周一至周六連續給藥6 d,每周稱重1次并記錄,根據體質量每周一進行1次藥量調整。

1.2.2骨密度檢測:開始灌胃給藥后,所有大鼠每4周檢測1次全身BMD,大鼠檢測前禁食不禁水12 h。大鼠麻醉后,俯臥位置于雙能X線BMD儀上檢測全身BMD。待8周后給藥組全身BMD顯著高于對照組后,處死所有大鼠,剝離左右側股骨及椎骨并檢測其離體BMD,之后將左側股骨固定于4%多聚甲醛固定液中,右側股骨放入0.9%氯化鈉溶液中-20 ℃保存。

1.2.3骨生物力學檢測:從-20 ℃冰箱中取出股骨置于0.9%氯化鈉溶液中,自然解凍,隨后進行三點彎曲實驗。將三點彎曲實驗:股骨固定在AG-X型萬能材料試驗機上,儀器參數為:跨距16 mm,加載速度10 mm/min。開始后壓力桿慢慢下落,直到股骨完全斷裂,電腦自動記錄股骨的最大載荷和彈性模量值。

1.2.4Micro-CT掃描:每組隨機從固定于4%多聚甲醛中的股骨中挑選6根,進行micro-CT掃描。開啟NMC-100 micro-CT儀,進行每日校準,打開采集軟件cruiser,設置掃描條件為:電壓70 kV,電流150 μA,分辨率為大離體倉標準模式。將骨膜標準品置于大離體倉放入儀器掃描,得到骨膜標準值并記錄。然后以同樣條件掃描大鼠股骨,用avatar軟件進行3D重建并完成圖像處理,以骨骺線下1.5～3.5 mm和5～7 mm的區域分別作為松質骨和皮質骨感興趣區域(regions of interest,ROI),隨后在骨分析區域輸入骨膜標準值進行骨分析,得到Tb. N、Tb. Th、BV/TV、Tb. Sp、骨小梁體積BMD和皮質骨體積BMD等數據。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 木香烴內酯對生長期大鼠體質量的影響

實驗過程中大鼠正常飲水飲食,精神狀態良好。大鼠體質量整體呈上升趨勢,第6周和第8周Control組體質量情況有輕微下降,實驗全程各組間大鼠體質量均無顯著差異(P>0.05,圖1)

圖1 生長期大鼠各組體質量變化(n=10)Fig.1 Changes in body weight of each group of rats in the growing period(n=10)

2.2 木香烴內酯對生長期大鼠BMD的影響

如表1,大鼠全身BMD結果顯示:4周末各組大鼠全身BMD無顯著差異(P>0.05)。而第8周時,CT-9組和CT-18組的全身BMD顯著高于Control組(P<0.05,P<0.01)。并且CT-18組的全身BMD高于CT-9組,但無顯著性差異(P>0.05)。如表2,各組大鼠離體股骨和椎骨BMD趨勢與各組全身BMD結果一致。

表1 生長期大鼠全身BMD檢測結果Table 1 Test results of whole body BMD of rats in growth period (g/cm2, n=10)

表2 生長期大鼠椎骨和股骨離體BMD檢測結果Table 2 BMD test results of in vitro rat vertebrae and

2.3 木香烴內酯對生長期大鼠骨生物力學的影響

如表3所示,大鼠股骨生物力學檢測結果顯示:給藥8周后,與Control組相比,CT-18組的最大載荷和彈性模量均顯著升高(P<0.01),而CT-9組的最大載荷和彈性模量雖有所升高,但無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠股骨最大載荷和彈性模量Table 3 Maximum load and elastic modulus of rat femur in each group n=10)

2.4 Micro-CT掃描分析結果

股骨micro-CT最大剖面圖(圖2)和股骨micro-CT骨小梁三維立體圖(圖3)均顯示:與Control組相比,CT-9組與CT-18組的骨小梁空隙明顯減小,數量明顯增多,連續性也更好,并且服藥劑量越高效果越好。骨分析量化數據也表明:與Control組相比,CT-9和CT-18組的相對骨體積、骨小梁數和體積骨密度均顯著升高,骨小梁分離度則顯著下降(表4,5)。但各組皮質骨無明顯差異(圖4),皮質骨體積骨密度也無明顯差異(表5)。

表4 生長期大鼠股骨micro-CT掃描松質骨量化指標分析結果Table 4 Analysis results of quantitative indicators of cancellous bone in micro-CT scans of rat femurs in the growing period n=6)

表5 大鼠股骨體積Table 5 BMD of rat femoral volume

注:A.Control組,B.CT-9組,C.CT-18組;黃色部位為松質骨分析區域。Note:A.the Control group, B. the CT-9 group, C. the CT-18 group. The yellow area is the analysis area of cancellous bone.圖2 大鼠股骨micro-CT最大剖面圖Fig.2 The largest micro-CT section of the rat femur

圖3 大鼠股骨micro-CT骨小梁三維立體圖Fig.3 Three-dimensional stereoscopic view of trabecular bone of rat femur by micro-CT

圖4 大鼠股骨micro-CT皮質骨三維立體圖Fig.4 Three-dimensional view of rat femur micro-CT cortical bone

3 討論

骨質疏松是一種悄悄發生的疾病,通常在發生第一次骨折前并不會有明顯的癥狀,一旦骨折發生就會給患者帶來嚴重的傷害,更有甚者會因此死亡[9]。OP的預防主要有兩種方法:增加峰值骨量和減少骨丟失速率,而峰值骨量(peak bone mass, PBM)是骨發育過程中所能達到的最大骨量,是骨骼堅硬程度和骨礦化水平最高的時期[10]。有研究表明,PBM每提高10%,骨質疏松性骨折的發生風險就降低50%[11],因此借助藥物提高幼齡期的PBM,是預防OP的一種有效手段。由于骨組織的健康水平由骨強度決定,所以提高峰值骨量預防骨質疏松的前提是加強骨強度。骨強度由骨密度和骨質量共同決定[11]。骨密度可通過雙能X線骨密度儀檢測,是診斷OP的金標準[12],而骨質量包括骨生物力學性能和骨顯微結構兩部分內容。本實驗主要圍繞骨強度相關指標評價了CT作為抗骨質疏松藥物的潛在價值。

實驗結果顯示,9、18 mg/kg CT均可以提高生長期大鼠全身BMD,對于離體的股骨和椎骨這些主要承重骨的骨密度也有提升作用;micro-CT結果也表明,CT可以明顯改善生長期大鼠的股骨骨微觀結構,使骨量增加;骨生物力學與抗骨折能力直接相關,本實驗中的骨生物力學檢測結果也表明,18 mg/kg CT可以提高生長期大鼠股骨的最大載荷和彈性模量,提高股骨的抗骨折能力;并且以上所有實驗結果均呈現劑量依賴性。

本實驗結果表明,CT可以劑量依賴性地提高生長期大鼠的骨強度,提示其有可能通過提高幼齡期的PBM而降低老年骨質疏松的發病率,可以作為先導化合物進行骨質疏松防治藥物的開發研究。