Ca2+、瓊脂及其協同效應對噬菌體分離的影響

薛佳楨,尚玉珠,任安琪,王云平,劉佳琪,李偉忠

（1.濰坊學院 種子與設施農業工程學院，山東 濰坊 261061；2.濰坊學院 生物與海洋學院，山東濰坊 261061）

尋找新的治療策略應對由多重耐藥菌（MDR）引起的感染成為了當今世界關注的熱點，而變“治病主”為“治環境”的治療策略，可通過影響環境中病原菌的分布和密度以達到治療目的[1]。生態環境中細菌的天然捕食者—噬菌體，在醫療、農業和食品等領域中受到人們廣泛關注[2-5]，尤其在生活生產環境、設備及農產品的消毒環節中。噬菌體分離的基礎是樣品中病毒粒子能否生成可見的噬菌斑[6]，高豐度和大成斑直徑是目標菌斑篩選的條件，影響這兩個條件的因素，必然會對噬菌體的分離效率和保留分離噬菌體的生物多樣性具有重要意義。通常在添加0.2%-0.7%瓊脂的半固體培養基內篩選噬菌體單斑，單斑直徑大小與瓊脂濃度呈負相關[7-9]，因此選擇適宜瓊脂濃度對噬菌體分離篩選至關重要。研究發現許多噬菌體附著宿主或胞內生長需要1-10mM 的Ca2+，具有增強分離效果[6,8,10]，噬菌體生成量顯著提高[8]。噬菌體生成量/效價以成斑數（PFU）計量，菌斑個數與單斑直徑之間具有依存關系：當單斑直徑太小，常規視野下未能識別，則無法計數造成效價降低；當一個感染中心釋放病毒粒子增多，高梯度勢能下粒子向外擴散變強，菌斑直徑相應擴大，則更易識別而效價增大。關于瓊脂對病毒粒成斑數量的影響和Ca2+對病毒成斑直徑的影響鮮有報道，因此，本試驗以大腸桿菌為指示菌和噬菌體P1 為模型，評價Ca2+和瓊脂對病毒成斑個數及直徑的影響，驗證試驗因素間是否存在協同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大腸埃希氏桿菌(E.coliATCC 25922)和E.coli噬菌體（P1），均由濰坊學院現代設施漁業研究院提供。LB 培養基、瓊脂及相關試劑均為國內產品。

主要試驗儀器包括恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、細菌濁度儀、恒溫振蕩搖床、低溫高速離心機、電子天平和漩渦混合器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制

底層LB 固體培養基：在1L 的LB 培養基中加入18g 瓊脂。

上層LB 半固體培養基：瓊脂添加量見表1。

表1 試驗分組與設計

1.2.2 指示菌液制備

將宿主菌劃線接種于固體LB 培養基上，放置于37℃恒溫培養箱過夜培養，用200μL 槍頭環挑取單菌落接種于20mLLB 液體培養基，37℃、160 g·min-1振蕩培養至對數生長期，用LB 培養基調整至0.5MCF（約1×108 CFU·mL-1），4℃保存備用。

1.2.3 噬菌體成斑評價

將噬菌體原液利用PBS 緩沖液進行10 倍梯度稀釋，分別取100μL 各個梯度的噬菌體稀釋液與制備菌液100uL 混合，靜止5min 后，加入含有（8-10mL） 48-60℃半固體LB 培養基的10mL 離心管中，上下顛倒混勻三次，快速倒入下層固體LB 平板中，晃動培養皿使其完全覆蓋，冷卻5min 左右，37℃倒置培養12h，觀察菌斑形態并統計個數，計算噬菌體效價。

1.2.4 試驗設計及分組

在1.2.3 試驗操作中，各組依據表1 試驗設計進行配制上層LB 培養基，每組3 次重復。

1.3 數據統計與分析

用Graph Pad Prism 9.1 軟件對菌斑計數結果進行雙因素方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 Ca2+對噬菌體成斑的評價

由圖1 和表2 試驗結果可以看出：與無鈣組相比，添加Ca2+組的培養基中噬菌體效價顯著增大（P＜0.01）；與處理組Ⅰ相比，Ⅲ組的單斑目測直徑更大且更加透亮，暈圈不明顯。結果表明菌斑的生成數量與形態特征均受Ca2+的影響。

圖1 噬菌體在不同LB 半固體培養基中成斑觀察

表2 噬菌體在不同LB 半固體培養基中的效價(mean±SD)

2.2 瓊脂對噬菌體成斑的評價

由圖1 和表2 試驗結果可以看出：與高濃度瓊脂(0.70%)相比，低濃度瓊脂(0.35%)培養基中成斑個數顯著增大（P＜0.01），目測直徑也明顯變大。結果表明菌斑的生成數量與形態特征均受瓊脂的影響。

2.3 Ca2+×瓊脂協同效應對噬菌體成斑的評價

由圖1 和表2 試驗結果可以看出：在同一視野下，P1 在Ⅲ組培養基中噬菌斑目測直徑最大且清亮；P1在Ⅲ組培養基中生成量最高，差異顯著（P＜0.01），瓊脂與Ca2+存在協同效應（P＜0.01）。

3 討論

噬菌體存在于水、土壤和沉積物的微生物生態系統中，貯量豐富，預估為1030-1032[11]。環境中噬菌體豐度雖高，但特定噬菌體時常難以分離而采用噬菌體的富集技術[9,12]。噬菌體富集過程令噬菌體的多樣性喪失，僅分離出占優勢且可有效繁殖的病毒。雙層瓊脂平板法是分離噬菌體的傳統方法，根據菌斑的形態特征而進行篩選目標。菌斑的形成中進行“反應-擴散”交替過程[13]，以感染中心為起點，伴隨菌斑的產生，一種或多種菌苔菌被噬菌體感染，釋放出的病毒粒子部分向外擴散，與其他細菌碰撞，然后感染其他細菌。病毒粒子向外呈被動擴散方式，從高濃度向低濃度遷移，勢能影響擴散速率，感染中心釋放病毒粒子越多則遷移速率越高；另外病毒粒子擴散速率也受瓊脂密度的影響[6,13,14]。因此，在規定時間內擴散速率越高，菌斑直徑就越大，更易被觀察，效價才能不被低估。

為確定噬菌體是否為需Ca2+型，頂層培養基中分別添加50mM 檸檬酸鹽和1-10mM Ca2+，若需Ca2+，效價則明顯降低[6]。當添加10mM Ca2+時，噬菌體Lc、Lpen 和Lbre 的效價比未添加Ca2+時增加達2-4 個數量級[8]。但在開展噬菌體分離試驗研究時，通常添加1-2mM Ca2+[6,15]，縮短噬菌體與指示菌吸附時間[6]，菌斑直徑就越大[13]，以提高分離效率。添加Ca2+組，P1 效價明顯增加（見表2），結果與前人研究一致，但對菌斑形態特征的影響鮮有報道。本試驗發現處理組Ⅲ生成噬菌斑平均直徑更大且更清晰（圖1 Ⅰ和Ⅲ），這與Ca2+能提高感染中心噬菌體產量[8]密切相關。另外暈圈在Ⅰ組清晰可見是由于裂解酶擴散速率高于病毒粒子[13,16]，而Ⅲ組不明顯可能因為病毒粒子的高勢能下的擴散速率與裂解酶擴散速率相當，掩蓋了暈圈的痕跡。以上提示噬菌體分離時，Ca2+還兼具有擴大菌斑直徑作用，避免菌斑太小而利于分離純化。

在生長培養基中通常添加瓊脂以防止培養液流動或混合，以限制物質的擴散。病毒粒子的擴散速率受瓊脂密度、分子長度和純度等因素的影響，導致噬菌斑直徑發生變化[13]，因此一般推薦瓊脂添加量為0.2%-0.7%進行噬菌體的分離[6,7,17]。Ellis 和Delbrück 研究發現[14]，頂層培養基中分別添加0.75%、1.5%和3.0%瓊脂，菌斑直徑分別為2、0.5 和0.2mm，瓊脂濃度與菌斑直徑成反比，這與本試驗結果相符（圖1）；但在添加高于0.75%瓊脂的培養基中，噬菌體成斑數量無明顯變化[14]，這與本試驗結果相悖（表2），這可能是高濃度瓊脂及病毒粒子物理特性共同阻滯此病毒粒子的擴散速度[13]，在規定時間內部分感染中心不可見。本試驗發現低濃度瓊脂培養基中，能明顯增加菌斑的產量，提示噬菌體分離時適當的低瓊脂濃度，可提高樣品中待選噬菌體的分離效率。

關于瓊脂與Ca2+是否存在協同關系，共同對噬菌體成斑狀況產生影響還未見報道。試驗發現Ca2+(2)×瓊脂(0.35)試驗組，效果最佳，兩因子間存在協同關系。其原因是病毒粒子數量與其成斑大小密切相關，其中一方變化，另一方隨之發生響應，此關系從上述結果中已得到證實。本研究提示：待選噬菌體的分離過程，要關注Ca2+與瓊脂的組合效應。

4 結論

本試驗中Ca2+、瓊脂及其協同對噬菌體P1 的成斑狀態具有顯著的影響，成斑狀態主要體現于成斑數量與噬菌斑直徑兩方面，能有效提高環境中病毒分離效率，盡可能增加噬菌體的多樣性，為清除病原菌提供更加多元的選擇，以提高特定病原菌的覆蓋度，為噬菌體制劑產業化奠定理論基礎。